实验九动物肝脏DNA提取和鉴定.pptxVIP

会计学;1、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。 3、学习核酸染色的方法。 ;二、实验原理:;选 材;研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。 组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒，可反复多次。 压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。;反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。 冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。;有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。;(三)除去RNA的方法 ;(四)除去蛋白质的方法 ;纯的DNA样品的获得;　　（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：;DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（电荷效应） 。 DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的分子筛效应）。 电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的确切位置。 溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。;荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激??EB发出波长为590nm的红橙色荧光。 溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含EB的溶液中浸泡. 溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。;琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素;琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：; 荧光染料EB染色后，在紫外灯(λ305nm)下观察到的电泳结果：; * 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？ 1、原理： EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。 激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收260nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。 ; 2、优点： （1）染色比较简便、快捷，一般在10－15min就可反应。 （2）EB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做 到的。 （3）EB灵敏度高，可检测出10ng或更少的DNA含量。 （4）既可用于DNA也可用于RNA的检测。 （5）EB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外 灯检测电泳的进程和效果。 （6）EB-DNA复合物中的EB发出的荧光比游离的EB强10倍， 因此不需洗净凝胶中游离的EB也可检测出DNA的条带。;3、缺点： 溴化乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行处理。 （1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭； （2）室温下放置1小时，不时的摇动； （3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液； （4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。 *溴化乙啶在260℃分解，在标准条件下进行焚化后不会有危险性。;(一)材料：动物肝脏 (二)试剂： （1）0.14mol／LNaCl－0.15mol／L EDTA-Na溶液： （2）20％SDS溶液： （3）氯仿一异戊醇(24:1)混合液： （4）95％乙醇溶液。 （5）80％乙醇溶液。 （6） 缓冲液：10 mmol／LTris－HCI，lmmol／L EDTANa，其中含RNA酶20ug／mL。 ;（7）电泳缓冲液：Tris-硼酸－EDTA（50×TBE）pH8.0。 （8）