实验六原生质体的分离和培养.pptxVIP

会计学 1 实验六原生质体的分离和培养 【实验原理】 植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后 为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研 究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维 素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素 酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除 去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内 部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须 保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。 其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液 的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质 体的影响。 第1页/共13页 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双 醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。 一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原 生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力 的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 第2页/共13页 【实验材料和用具】 材料：菊花花瓣愈伤组织或烟草幼苗叶片等。 用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛，漏斗，烧杯，滴管，10ml刻度离心管，血球记数板等。 第3页/共13页 【实验材料】 材料：烟草幼苗叶片或菊花花瓣愈伤组织等。 第4页/共13页 【实验仪器和用具】 仪器和用具：摇床、离心机、显微镜、过滤器，注射筒，不锈钢网筛，漏斗，烧杯，滴管，10ml刻度离心管，血球记数板等。 第5页/共13页 【实验试剂】 (1)酶解液：2%(W／V) 纤维素酶,1% (W／V)果胶酶／L甘露醇。 (2) 洗涤液： ／L甘露醇 (3)0.02%二乙基荧光素(FDA):5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下贮存,使用 时取贮存液加入甘露醇中.使用时,使最终浓度为0.01%。 (4) DPD培养基 第6页/共13页 【实验内容】 (1)取充分展开的叶片,用自来水冲洗干净。 (2)在超净工作台上,叶片用％升汞溶 液中浸泡灭菌10min(中间摇动几次)。取出叶片,无菌蒸馏水漂洗5次。 (3)将叶片放入大培养皿中,吸去水分,叶背面朝上,用无菌镊子小心撕去下表皮,或用解剖刀将叶片切成宽的小条。 (4)另取1个培养皿或带盖的三角瓶,加入酶解液10mL,放叶片约2g,浸泡。 (5)在28C保温3～6h,中间轻轻摇动2—3次。 第7页/共13页 (6)用200目筛网过滤酶解液,滤液经 600×g离心5min,使原生质体沉淀下来。 (7)用移液管吸去上清液,将沉淀的原生质体悬浮在／L CaCl2·2H20 2mL中。 (8)用注射器(装上长针头)向离心管底部缓缓注入20％蔗糖6mL,在600×g离心5min。 这时,在两相溶液的界面之间出现一层纯净的完整原生质体,杂质和碎片都沉到管底。 (9)取原生质体提取液1滴于载玻片上,加入相同体积的 ％FDA稀释液,静置5 min 后,于荧光显微镜下观察,发绿色荧光的为有活力的原生质体,没有产生荧光的原生质体无活力。 第8页/共13页 2～3周龄愈伤组织和叶片各约1g和g，叶片剪成细条 加入到酶液中、用镊子分散愈伤组织 黑暗、 25℃酶解3~6小时，间歇轻轻摇动。 愈伤组织和叶肉原生质体分离 第9页/共13页 过滤和离心洗涤原生质体 过滤 800rpm离心3min 弃上清液 加入3ml CPW培养基，用滴管重新悬浮原生质体 800rpm离心3min 弃上清液,重新悬浮在ml CPW溶液中 第10页/共13页 【实验报告】 分别述说你观察到的三张临时装片的结果,你认为此种分离与纯化原生质体的方法如何,有无可改进或优化之处？ 第11页/共13页 【思考题】 1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体,在实验中应注意那些问题? 2.除了本实验介绍的方法,还可以用哪些 方法判断分离的原生质体活力? 第12页/共13页