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海产品中蜂房哈夫尼菌的鉴定及相关特性研究 蜂房哈夫尼（Hafnia alvei）是革兰阴性、运动、有鞭毛的兼性厌氧杆菌，可在培养基上生长，菌落一般为灰白色，呈圆形，有轻微的不规则边缘。蜂房哈夫尼生存范围广泛，存在于人和动物的粪便、河流、海洋和土壤中，在特定条件下，可引起人类多种肠道感染疾病，通常被认为是一种条件致病菌[1-2]。 蜂房哈夫尼是真空包装、气调包装食品中一种常见的优势腐败菌，常常造成富含蛋白质的水产品、肉制品、乳制品在低温冷藏时发生腐败变质。研究发现，在真空包装的红肉和白肉制品中，哈夫尼菌属为优势腐败菌的几率高于76%[3]。在真空包装的肉制品中，蜂房哈夫尼菌和沙雷氏菌为主要的腐败肠杆菌[4]。气调包装（MAP）的鲑鱼肉低温冷藏时，优势腐败菌为蜂房哈夫尼菌[5]。南亚、东南亚地区流行的真空包装鱼糜制品中蜂房哈夫尼菌为主要致腐微生物[1]。超高温灭菌乳在7 ℃冷藏条件下，蜂房哈夫尼菌的生长速度及腐败贡献要高于荧光假单胞菌[6]。 目前关于蜂房哈夫尼菌的报道不多。本课题组一直从事海产品安全的研究，发现蜂房哈夫尼可在含盐5%的培养基中正常生长，在海产品原料及产品中较为常见，在海产品的腐败，尤其是生物胺产生方面贡献突出。本课题组从虾酱中分离出3 株（G1、G4 和G5）、从鱼露中分离出1 株（Y1）、从即食海参中分离出1 株（H4）蜂房哈夫尼菌。通过研究海产品中蜂房哈夫尼菌相关特性，进一步明确该菌的致腐特性，更有针对性的控制该菌在海产品安全方面的危害作用。 1 材料和方法 1.1 试验菌株及培养条件 菌种来源：分离自虾酱（辽宁，盘锦）中的G1、G4、G5 菌株；分离自鱼露（山东，威海）中的Y1 菌株；分离自腐败即食海参的蜂房哈夫尼菌（H.alvei H4）H4 菌株；分离自腐败大菱鲆的蜂房哈夫尼菌HA-01 由大连民族大学李婷婷副教授馈赠。上述菌株均使用LB 培养基，在30 ℃条件下培养。 1.2 试剂和仪器 结晶紫染液，上海生工生物；各类抗生素，索莱宝试剂有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司；ExTaq DNA 聚合酶，大连Takara；各类培养基，北京奥博星生物技术有限公司；赖氨酸盐酸盐、鸟氨酸盐酸盐、组氨酸盐酸盐、酪氨酸盐酸盐、色氨酸盐酸盐和盐酸吡哆醛，上海Aladdin。 1260 高效液相色谱，美国安捷伦；高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher；UV 2102 型紫外分光光度计，日本岛津；SpectraMax M2 多功能酶标仪，美国MD；自动凯氏定氮仪，山东海能科学仪器有限公司。 1.3 细菌的分离、鉴定 1.3.1 菌种16S rRNA 鉴定及其系统进化树构建 提取G1、G4、G5 和Y1 菌株的DNA，用16S rRNA 基因通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3’）PCR 扩增菌株的16S rRNA 基因。反应体系：Premix Ex Taq 酶25 μL；上下游引物各1 μL；DNA 模板1 μL，加ddH2O 至50 μL。PCR条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min。将PCR 产物送至上海生工生物公司测序，测序结果在NCBI 网站进行比对分析。采用Mega 6.0 软件将6 株菌的16S rRNA 序列与GenBank 中比对后同源性较高的菌株的16S rRNA 序列构建系统进化树[7]。 1.3.2 生理生化鉴定 试验方法参考《常用细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第9 版[8]，中蜂房哈夫尼菌的鉴定方法，对G1、G4、G5 和HA-01 菌株进行如下生理生化试验鉴定：革兰氏染色、鞭毛染色、动力实验、氧化酶试验、糖醇类发酵、MR 试验、V-P 试验、吲哚试验、ONPG 试验和硫化氢试验，观察试验结果。 1.4 蜂房哈夫尼菌特性研究 1.4.1 生物膜 参照Pratt[9]和李婷婷[10]等学者的试验方法，采用96 孔板结晶紫染色法进行测定，培养7 d，每24 h 测定1 次，每个菌6 个平行。金黄色葡萄球菌为阳性对照，空白LB 培养基为阴性对照。用酶标仪测定OD590nm?吸光值。 1.4.2 泳动性 参照Cong 等[11]和Hidalgo 等[12]学者的方法并作适当修改，利用平板扩散法测定各菌株的泳动能力。将过夜培养的菌液用移液枪吸取3 μL 点到凝固的Swimming 平板的中心位置，静置30 min 后移至30 ℃培养箱中培养，观察结果。空白培养基作为对照，每组3 个平行。 1.4.3 耐盐性试验 将细菌分别接种到含有不同盐质量浓度（0，0.01，0.