高效液相色谱 (2).pptVIP

流动相 1）离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。 2）通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。 一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为： 柠檬酸离子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞ Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。 阳离子的滞留次序大为： Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十 差别不如阴离子明显。 3）关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。 第六十三页，共一百一十一页，2022年，8月28日 (六)亲和色谱法（AC） 1）亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。 2）通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。 3）固载化的配基只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。图20-9为亲和色谱法示意图。 第六十四页，共一百一十一页，2022年，8月28日 固定相：载体和配基 载体：具有多孔网状结构，具有相当数量可供耦联的基团，能结合配基，无吸附性，均一，有一定硬度，性质稳定。常用的有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、多孔玻璃 配基：对亲和物有专一的亲和力，有能与载体相连的基团，如腺嘌呤核苷酸吸附剂，核苷酸吸附剂等 流动相：缓冲溶液 应用：生物大分子分离和分析 第六十五页，共一百一十一页，2022年，8月28日 分离类型的选择 1．根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O-2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用排阻法为最佳。 2．根据溶解度选择 弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液一固吸 第六十六页，共一百一十一页，2022年，8月28日 附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。 3．根据分子结构选择 用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物或不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。 现列表作为选择分离类型的参考。 第六十七页，共一百一十一页，2022年，8月28日  液相色谱分离类型选择参考表 溶于水——排阻色谱，水为流动相 相对分子质量 ＞2000 不溶于水——排阻色谱，非水流动相 同系物——分配色谱 不溶于水 异构体——吸附色谱 样品 分子大小差异——排阻色谱 反相液一液色谱 相对分子质量 溶于水，不离解 ＜2000 排阻色谱，水为流动相