蛋白质的化学修饰.pptVIP

第一页，共三十六页，2022年，8月28日 主 要 内 容 化学修饰的原理 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 蛋白质化学修饰的应用 蛋白质化学修饰的局限性 第二页，共三十六页，2022年，8月28日 一、化学修饰的原理 概念：从广义上说，凡是通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为蛋白质的化学修饰。 有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性(称非必需部分的修饰); 但大多情况下将导致生物活性的改变(如下降以至完全丧失)。 影响蛋白质化学修饰反应进程的因素： 1.蛋白质功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。 第三页，共三十六页，2022年，8月28日 主 要 内 容 化学修饰的原理 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 蛋白质化学修饰的应用 蛋白质化学修饰的局限性 第四页，共三十六页，2022年，8月28日 二、蛋白质侧链的修饰 蛋白质侧链的修饰主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。其重要作用是用于探测活性部位的结构。 理想情况下, 修饰试剂只是选择性地与某一特定的残基反应, 很少或几乎不引起蛋白质分子构象变化。 在20种常见AA残基中，仅具极性的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。 第五页，共三十六页，2022年，8月28日 蛋白质侧链的修饰 2.1 特定的AA残基侧链基团的反应试剂（4种方法） 2.2 巯基的化学修饰 2.3 氨基的化学修饰（3种方法） 2.4 羧基的化学修饰 2.5 咪唑基的化学修饰 2.6 二硫键的化学修饰 第六页，共三十六页，2022年，8月28日 2.1 特定的AA残基侧链基团的反应试剂（4种） 2.1.1 酰化及其相关反应 这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，在室温(20oC~25oC)，pH 4.5 ~9.0的条件下可与蛋白质某些侧链基团如 -NH2、-OH、-SH及酚基等发生酰基化反应。 第七页，共三十六页，2022年，8月28日 2.1.2 烷基化反应 此类试剂 ( 如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物、碘甲烷等 ) 常带有活泼的卤素原子，因其电负性而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋白质分子的亲核基团 ( 如-NH2、-SH、 -COOH、 -SCH3和咪唑基 ) 发生烷基化。 第八页，共三十六页，2022年，8月28日 2.1.3 氧化和还原反应 H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等具有很强氧化性，能将侧链基团( -SH\-SCH3\吲哚基\咪唑基和酚基)氧化, 往往易使肽链断裂(故要控制好氧化条件); 光敏剂存在下的光氧化是比较温和的氧化作用。 2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)等主要用于-S-S-的还原剂。 连四硫酸钠或钾是一温和的氧化剂，常用于-SH的可逆保护剂。 第九页，共三十六页，2022年，8月28日 2.1.4 芳香环取代反应 蛋白质AA残基的酚羟基在3和5位上易于发生亲电取代的碘化和硝化反应。这类修饰反应的典型例子为四硝基甲烷(TNM), 可以作用于Tyr的酚羟基, 形成3-硝基Tyr衍生物。这种产物有特殊光谱，可用于直接的定量测定。 第十页，共三十六页，2022年，8月28日 蛋白质侧链的修饰 2.1 特定的AA残基侧链基团的反应试剂（4种方法） 2.2 巯基的化学修饰 2.3 氨基的化学修饰（3种方法） 2.4 羧基的化学修饰 2.5 咪唑基的化学修饰 2.6 二硫键的化学修饰 第十一页，共三十六页，2022年，8月28日 2.2 巯基的化学修饰 巯基具有很强的亲核性，是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。常用的修饰剂有3种： 1.烷基化试剂特别是碘乙酸和碘乙酰胺是很重要的-SH修饰剂。修饰产物相当稳定，易于分析。此类试剂还能与Met\Lys\His反应。 第十二页，共三十六页，2022年，8月28日 2.有机汞试剂是最早使用的-SH修饰剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸，它与-SH形成的衍生物在250nm处有最大吸收，可容许低浓度蛋白质的光谱定量分析。其中2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)与蛋白质分子中侧链-SH反应很快,并在395nm处产生1个负差吸收峰. 3.-SH的氧化也是一种专一性很高的化学修饰手段. H2O2一般用于氧化-SH形成-S-S-或在较大量时形成磺酸，也可以生成次磺酸。 第十三页，共三十六页，2022年，8月28日 蛋白质侧链的修饰 2.1 特定的AA残基侧链基团的反应试剂（4种方法） 2.2 巯基的化学修饰 2.3 氨基的化学修饰（3种方法） 2.4 羧基的化学修饰 2.5 咪唑基