14第十四章-组学技术及其在食品安全检测中的应用.pptxVIP

第十四章 组学技术及其在食品安全检测中的应用现代食品检测技术 代谢组学第一节蛋白质组学目录2/38第二节脂质组学第三节 第一节 蛋白质组学3/38（一） 蛋白质组学蛋白质组（proteome）一词来源于蛋白质（protein）和基因组（genome）的组合，主要是指一个由基因组表达产生相应的全套蛋白质，而蛋白质组学（proteomics）则是指对某一生物或细胞在特定生理状态下表达的所有蛋白质的特征、数量和功能进行系统性的研究。该技术在食品科学领域的应用，主要是基于差异蛋白质组学技术对食品在不同状态或条件下的蛋白质组分和含量的变化进行对比，以及对蛋白经糖基化、磷酸化等修饰后的变化进行特征性描述，在食品加工与贮藏、食品营养与品质分析、食品过敏原检测以及食品真伪鉴别等方面得到广泛应用。 第一节 蛋白质组学4/38（二） 蛋白质组学技术随着蛋白质样品制备技术、蛋白质组分分离技术、质谱分析技术以及蛋白数据分析工具的快速发展，以质谱技术为核心的蛋白质组学技术日渐成熟，具体研究的基本流程如图14-1所示。样品中蛋白质组分经提取后，通常采用自下而上或自上而下两种策略进行分析。图14-1基于质谱技术的蛋白质组学分析流程简图 第一节 蛋白质组学5/38自下而上（bottom-up）中的“bottom”指肽段，而“up”则是由肽段推理蛋白质的过程。在自下而上的方法中，蛋白质单体首先在蛋白酶的水解作用下分解成为不同大小的肽段，然后通过色谱技术将肽段混合物分离，随后利用质谱技术将肽段碎裂，并根据碎裂谱图中的离子峰信息，结合相关数据库对肽段进行搜索和鉴定，最后将得到的肽段组装合并形成蛋白质。该技术成熟，对应的软件工具选择范围广，适合分析复杂样本。但缺点是蛋白序列的覆盖度并不完整，不适合对蛋白翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）的检测分析）。在自上而下（top-down）这一蛋白质组分析策略中，“top”是指对完整蛋白质分子的分析测定，“down”则是指对完整蛋白的碎裂。随着近年来质谱仪解析能力的大幅提高和新型串联质谱MS/MS离子裂解技术的出现，这种不采用酶解反应，而是直接通过完整蛋白质的质量及其碎裂谱图信息来完成蛋白质鉴定的分析方法，针对蛋白质序列的覆盖度很高，比较适合对蛋白质的翻译后修饰位点进行分析。但该方法不适合分析复杂样本，无法满足高通量蛋白分析，并且对于仪器的解析能力要求较高。 第一节 蛋白质组学6/38上述两种蛋白组学研究方法中主要包括了蛋白质组分的分离技术、蛋白质组分的鉴定技术以及利用蛋白质信息学进行蛋白质结构和功能的分析与预测这三个部分。1. 蛋白质分离技术，蛋白质组分的成功分离是蛋白质组学研究的基础，也是影响蛋白质表征结果的关键因素之一。目前常用的蛋白质分离技术主要包括电泳技术（一维电泳、双向电泳、荧光差异显示凝胶电泳、毛细管电泳）和液相色谱技术（离子交换色谱、亲和色谱、多维液相色谱），这些分离技术均可与下游质谱技术联用。一维电泳分离技术示意图 第一节 蛋白质组学7/38双向凝胶电泳技术示意图双向荧光差异凝胶电泳毛细管电泳分离原理 第一节 蛋白质组学8/38ICAT标签试剂结构5. 高效液相色谱。液相色谱可在双向电泳技术的上游对蛋白质样品进行预分级；也可以在双向电泳的下游使用，对单个蛋白质中的多肽混合物进行细分；还可以代替双向电泳技术，直接对蛋白质进行分离分析。HPLC按待分离组分在固定性和流动相之间分离机理的不同，主要可分为离子交换色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、疏水作用色谱、亲和色谱以及色谱聚焦等。6. 稳定同位素标记法。利用含有同位素的标签来造成质量差异，用不同的同位素标签对蛋白组分别标记后再进行比较。由于同位素除了质量差以外，在结构和化学性质上均非常相似，因此其保留时间在液相色谱中也非常接近，经依次流出液相色谱后进入质谱仪，并形成特定质量差异的多肽对，通过质谱信号的强度大小来完成相对定量。有同位素编码亲和标签技术（ICAT）。 第一节 蛋白质组学9/382. 蛋白质鉴定技术，蛋白质是由20种氨基酸按照一定顺序、通过肽键形成长链，并通过链内、链间的离子键、疏水作用等进行折叠和卷曲形成，而氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构和功能。目前，分析蛋白质一级结构的主要方法为蛋白质测序法和质谱测序法）。图14-8 蛋白质N端测序的化学反应过程 第一节 蛋白质组学10/38蛋白质N端测序，是以Edman化学降解法为基础的一个循环式化学反应过程，主要包括以下三个步骤（图14-8）：首先，蛋白质和多肽的自由N端残基与异硫氰酸苯酯（PITC）试剂在碱性条件下，偶联形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-蛋白质/肽；其次，PTC-蛋白质/肽发生环化裂解，N端残基被