基因工程的基本技术序列分析.ppt

第一页，共二十七页，2022年，8月28日 第三节 DNA序列分析 Sanger双脱氧链终止法 Maxam-Gilbert化学裂解法 1 2 第二页，共二十七页，2022年，8月28日 测序的常用方法 1. 末端终止法 2. 化学裂解法 3. DNA测序自动化 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序 类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出 优点 简便、迅速、应用广泛 不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序 1. 高负荷，1块胶可测16个样品； 2. 机读不需放射自显影； 3. 安全不用同位素； 4. 简单迅速8-10h 第三页，共二十七页，2022年，8月28日 Sanger双脱氧链终止法(chain-terminator method) 1977年Sanger充分利用DNA复制的生物学特性, 设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法, 进行DNA序列测定,即双脱氧链终止法 因Sanger法测定了碱基序列, 获得1980年诺贝尔化学奖 (注：1958年因用酶法测得人胰岛素的氨基酸排序而得诺奖) 一、 第四页，共二十七页，2022年，8月28日 1.Sanger双脱氧链终止法原理 基本原理： 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子； 利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP 3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。 第五页，共二十七页，2022年，8月28日 第六页，共二十七页，2022年，8月28日 2 具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。 第七页，共二十七页，2022年，8月28日 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下: 在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT. 将得到如下结果： 1 产生的都是以A结尾的片段: GA,GATCCGA。 2 3 4 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 第八页，共二十七页，2022年，8月28日 制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。  第九页，共二十七页，2022年，8月28日 3、技术路线： 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 第十页，共二十七页，2022年，8月28日 4.双脱氧终止法测序反应体系： DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3’-OH末端的单链寡核苷酸引物 Mg2+ 4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) 第十一页，共二十七页，2022年，8月28日 Sanger法DNA测序的试剂 ① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡结构 ② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸 （