酶工程-实验5工业酶基因的克隆及表达.pptxVIP

实验五工业酶的基因克隆及表达;1 实验目的和要求;2 实验原理;3 酶基因表达的一般过程; 聚合酶链式反应，又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。最大优点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。;（2）限制性内切酶（restriction endonuclease） 能识别碱基构成特异的一段（4~8 bp）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的一种蛋白酶。 每种酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，一般为回文序列。;;（4）酶基因：CALB（Candida antarctica Lipase B , 南极假丝脂肪酶B ）;（5）表达载体 目的基因能够表达的载体。本实验所用的质粒为毕赤酵母表达载体pPIC9K，多克隆位点中插入了不包含信号肽序列的CALB基因编码区，该质粒能转化至酵母菌中，由5′AOX1启动CALB编码区的转录后翻译成蛋白，从而获得大量的重组蛋白。;5 仪器;菌株：pichia pastoris GS115,Escherichia coli Top10 工业酶制剂基因：CALB（南极假丝酵母脂肪酶B） 限制性内切酶： EcoRI 和NotI。 T4 DNA 连接酶。 质粒：pMD18T-CALB,pPIC9K 培养基：LB培养基,YPD培养基,BMGY培养基,BMMY培养基 抗生素：Kna（浓度