解淀粉芽孢杆菌中基因敲除体系的建立.pdfVIP

摘要 目的：解淀粉芽孢杆菌在自然环境中广泛分布，易于分离和培养，对人类和 人类无毒无害。其代谢物丰富，具有广谱抗菌活性，抗逆性强，生长快，稳定性 好，在植物病害的防治中具有多种有益作用，非常适合生物的大规模生产和应用。 本研究基于实验室中先前的实验并使用现有的质粒 pKSV7，本研究尝试选择合适 的反向筛选标记以使无痕基因操作成为可能，并为解淀粉芽孢杆菌C10 的遗传 修饰提供强大的工具。 方法：相关研究显示，在菌体内体外胸腺嘧啶类似物 5-FU 可以生成有毒物质 5- dUMP，利用这一原理可以敲除解淀粉芽孢杆菌C10 内的upp 基因，之后获得 C10Δupp 这一突变菌株，基于这一底盘细胞可以进行自杀型基因敲除载体 pKSU- ΔamyA 的构建，此载体内含有upp 基因，并成功敲除了 C10 中的amyA 基因片 段。 结果： 1. 构建的 pKSV7-Δupp 载体经酶切以及测序确认载体构建成功。在探索解 淀粉芽孢杆菌 C10 的电转化条件后，确定通过 LB 培养基过夜培养的解淀粉芽孢 杆菌 C10 在 LBS 培养基（每升水 0.5 M 山梨糖醇，10 克氯化钠，10 克胰蛋白 胨和 5 克酵母提取物）中转接，同时添加 0.64%甘氨酸溶液，0.05%Tween 80 （w/v ）溶液，1.02%DL -苏氨酸溶液，32 ℃振荡培养至 OD600=0.9 。重悬感 受态细胞时用 MSG 缓冲液（0.5 M 山梨糖醇，0.5 M 甘露糖醇和 10％甘油）。 电转化时预设电压为2000V，电击时间为 5ms,电击后加900 uL 复苏培养基（LB 培养基里加 0.5 M 山梨醇，0.38M 甘露醇），180rpm 32℃复苏 3h，涂布含Cm 的 LB 平板。 2. 经过对 upp 基因敲除菌株 C10Δupp 菌株和原始菌株 C10 进行了生长曲 线测定，发现 upp 基因的缺失对菌株生长速率没有影响。以此为依据可以在解 淀粉芽孢杆菌的遗传学改造过程中将 upp 基因作为菌株的反向筛选标记基因。 3. 在 pKSV7 载体中移入 upp 基因，再一次将含有 upp 表达盒的反向筛选 质粒 pKSU 通过接合转移导入解淀粉芽孢杆菌 C10Δupp 。将重新导入upp 基因 的突变菌株C10Δupp （pKSU）和突变菌株 C10Δupp 在 0.35mM 的 5-FU 的平 板上涂布，在此平板上含有 upp 基因的突变菌株 C10Δupp （pKSU）出现生长异 常，这表明含有 upp 基因的菌株对 5-FU 具有较高的敏感度，这一现象也从侧面 表明了在对解淀粉芽孢杆菌进行遗传学改造时，upp 基因可以作为一种反向标记 基因。 4. 构建敲除载体 pKSU-ΔamyA ，经过电转化进入突变菌株C10 Δupp ，经过 氯霉素与 5-FU 敏感性检测后，得到突变菌株 C10 Δupp ΔamyA 。同时对突变菌 株C10 Δupp ΔamyA 进行了淀粉酶水解实验。实验结果显示，突变菌株C10 Δupp ΔamyA 由于α-淀粉酶基因的缺失，不能形成水解圈。实验的成功证实了解淀粉 芽孢杆菌 C10 中基因敲除体系的成功建立，为后续在解淀粉芽孢杆菌C10 中的 遗传操作奠定了基础。 关键词：解淀粉芽孢杆菌；载体构建；upp ；基因敲除 Abstract Objective: Bacillus amyloliquefaciens is widely distributed in the natural environment, easy to isolate and culture, non-toxic and harmless to humans and humans. It is rich in metabolites, has broad-spectrum antibacterial activity, strong stress resistance, fast growth, and good stability. It has a variety of beneficial effects in the control of plant diseases and is very suitable for large-scale production and application of organisms. This