Twistdx公司技术介绍RPA技术介绍TwistDx客户常见问题汇总.pdfVIP

1. 在 TwistAmp® exo (RT) 反应即将结束时，有时会看 到荧光急剧 增强，这正常吗？ Q ：在 TwistAmp® exo (RT) 反应即将结束时，有时会看到荧光急剧 增强，这正常吗？ A ：正常。在 TwistAmp® exo 反应中，聚合酶和核酸外切 III 处 于竞争关系。随着反应的能量逐渐耗尽，核酸外切 III 开始 占据优势，结果导致探针更快速地裂解和荧光信号出现剧增。 2. 在采用小 TwistAmp® Liquid 反应体积时如何避免再 现性问题？ 在采用小 TwistAmp® Liquid 反应体积时如何避免再现性问题？ 移取小体积液体亚组分时可能发生再现性问题，因为可能发生移液误差并影响可变的组分 比例。建议配制含 Core Reaction Mix 、E-mix 等的预混液，这样应该可以提高再现性。如 果无法配制预混液，反向移液也可提高再现性。 3. 英国 TwistDx Inc 的商务总监 Tony Hill 访问生物公司 一个月内，顶级学术期刊连发两篇顶级论文！上半年引爆生物圈的华人科学家张锋教授团 队又有新动作！这次，他在一月内，分别在《Nature》、《Science》连发两篇论文！他将 CRISPR-Cas13a 改造成了灵敏度达到了阿摩尔级（aM ，10 的负 18 次方摩尔每升），可以检 测单分子的 SHERLOCK 技术。而这其中，RPA 起到了不小的作用。 那么，什么是 RPA 呢？ RPA,即重组酶聚合酶扩增技术，是在由多种酶和蛋白的参与下，在恒温条件下实现核酸指 数扩增的技术，被称为是可以替代 PCR 的核酸检测技术。 RPA 技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链 DNA 结合蛋 白(SSB)和链置换 DNA 聚合 。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在 37 °C 左右。 RPA 的反应原理 RPA 的反应过程，首先是重组酶与引物结合，形成蛋白-DNA 复合物。接着在 dsDNA 中寻找 同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动 DNA 合成，对模板 上的目标区域进行指数式扩增。而被替换的 DNA 链与 SSB （单链DNA 结合蛋白）结合，防 止进一步被替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得 非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。 RPA 与相关技术的比较 与 PCR 实验相比，RPA 实验能在恒定温度下进行全程实验，没有复杂的操作，对仪器及 人员的要求不高，适合基层或现场快速诊断。 而另一种新兴技术，LAMP (Loop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介 导等温扩增反应”，由于其简便的操作，也被视为 PCR 技术强有力的竞争者。在此，让我 们对比下 LAMP 与 RPA 两种试剂盒进行的实验： 上月，RPA 技术的开发公司——英国 TwistDx Inc 的商务总监Tony Hill 来到了我公司， 为我们深入介绍了 RPA 技术，及 TwistDx 的各类产品。 Tony 还与我公司的技术人员一同拜访上海市农业科学院及上海阅尔基因技术有限公司， 分别向赵凯研究员及其研究生，以及阅尔基因的研究人员介绍了 RPA 技术，解答他们在使 用中遇到的问题。 英国 TwistDx 公司（前身为 ASM 科技有限公司）成立于 1999 年，基于英国剑桥 Babraham 研究院建立的生物技术公司。该公司通过突破等温 DNA 扩增，开发的重组 聚合酶扩增专利技术（RPA），被誉为 DNA 诊断领域的革命性创新。 TwistDx 以此技术为基础生产的核酸扩增类产品，能在恒定且较低的温度下，仅用 10~20 分钟，进行单分子核酸检测。这一技术对环境、硬件设施的要求很低，对于生物防护、水 体检验、食品检验、医疗诊断、微流体、兽医等方面都有良好的应用。 RPA 扩增的各种体系试剂盒中，含有 DNA、RNA 扩增所需的所有试剂，研究者只要准备 好引物和模板就行了。扩增结果可以分别通过凝胶电泳检测、荧光定量检测或试纸条检 测，产物纯化后可用于下游研究。 默瑞（上海）生物科技有限公司与英国 TwistDx 公司达成战略合作，负责 RPA 技