2023届全国新高考生物冲刺复习 PCR引物设计原则.pptxVIP

备战2023高考2023届全国新高考生物冲刺复习PCR引物设计原则 PCR引物 是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补， 另—个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。 PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和高效性。扩增特异性扩增高效性引物引物长度要适宜引物GC含量要适宜引物自身及引物之间不应存在互补序列引物5端可以修饰，3端不可修饰退火温度要适宜①②③④⑤01. PCR设计的原则 引物设计要点（1）? 一般，引物的长度为15-23bp，常用的长度为 18-21bp。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq 酶进行反应。过短特异性差。 引物设计要点（2）?引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高， 而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 3端防止连续三个C或G?引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。? 引物设计要点（3）?碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。 ?1、发夹结构（Hairpin） 自身互补 2、二聚体（Dimer） 两个引物间互补发夹结构二聚体 引物设计要点（4）引物的5端可以修饰，而3端不可修饰引物的5 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。在引物的5`端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。 abab双酶切优点：使DNA片段能定向插入表达载体，防止自连 如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。引物设计要点（5）退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高。思考原因是什么？ 1.研究者将T-DNA插入到拟南芥的D基因中，致使该基因失活，失活后的基因记为d。根据D基因、T-DNA的部分序列，设计了三种引物，如下图所示。欲鉴定某植株的基因型，应选择的引物组合是：（ ） A．Ⅰ+Ⅱ B．Ⅰ+Ⅲ C．Ⅱ+Ⅲ D．Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ【思维提升练习】B 【详解】引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的，一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点。引物只能与基因的3端结合，因此，参考D基因的左侧3端和T-DNA右侧的3端可选择引物Ⅲ和Ⅰ，可知D基因内是否插入了T-DNA。故选B。 【思维提升练习】2.通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是（????）A．在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核糖核苷酸、解旋酶、Taq DNA聚合酶等B．第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于DNA聚合酶识别和结合D．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4D 【详解】A、在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、Taq酶等，不需要加入解旋酶，A错误；B、第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因，其中②较长，B错误；C、引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向定点插入运载体，避免发生自身环化，C错误；D、在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，总DNA分子共8个，所以比例为1/4，D正确。故选D。 3.为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：（1）利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌