为啥我的基因敲除小鼠还能检测到敲除的目的蛋白.docxVIP

— — PAGE 1 — 为啥我的基因敲除小鼠还能检测到敲除的目的蛋白  随着基因编辑技术的迭代更新和模型构建费用的降低，基因敲除（KO）小鼠使用已成为学者开展科研项目时的优先选择项。市售的成品敲除模型鼠种类繁多，在经历了相当长时间的繁育等待后，拿到纯合子敲除模型的小伙伴最后发现仍能检测到敲除的目的蛋白表达！？缺少这么重要的数据，下一步课题怎么开展？论文怎么发表？科研经费和时间都被浪费掉了，真是赔了夫人又折兵啊。  济世金编根据多年的实践经验，帮助各位学者理清可能原因：  1、蛋白验证的影响因素：  1)抗体的特异性：非特异性条带是蛋白检测中最常见的问题，使用高质量、特异性强的抗体是获得可靠结果的关键。针对这一问题，可以结合PCR的方法对敲除基因mRNA的表达进行检测，当未检测到敲除基因mRNA表达的情况下，需要考虑更换另一家公司抗体进行检测目的蛋白。  2)抗体的结合位点：移码突变型的敲除可以表达出目的基因N端的部分肽段，如果所使用的抗体结合位点刚好在表达的残留蛋白上是可能被检测到的。所以在选择抗体的时候尽可能选择识别C端肽段的抗体。 2、基因敲除方式的影响因素：  市面上绝大多数的成品敲除模型采用的是移码突变的构建方式，这些模型只经过了基因组DNA的PCR验证，表明移码突变成功；但未进行RT-PCR（mRNA表达）或WB（蛋白表达）的验证。移码突变是指DNA链上插入或缺失1个、2个甚至多个碱基（非3个碱基或3的整数倍的碱基），导致在插入或缺失碱基部位以后的密码子顺序和组成发生相应改变。这种构建方式的弊端是：由于原来的密码子移位，终止密码子常常推后或提前出现，结果造成新合成的肽链延长或缩短，容易出现截断蛋白残留，对抗体的结合位点产生干扰。  更要命的是，移码突变的模型构建方式有可能导致未知肽段或蛋白的生成。这使我们无法确认利用这种敲除方式准备的模型，其病理或功能上的表型是否是由目的基因功能缺失引起的，甚至会影响到整个研究的结果。 3、推荐的解决方案：  目的基因完全敲除的小鼠模型构建方式  这种构建方式是在受精卵胚胎中精准地完全删除或尽可能删除最大片段的目的基因组序列。通过这种方式构建的基因敲除小鼠，其目的基因无法进行转录，最大程度的避免了前面提到的移码突变敲除方式所带来的检测问题及潜在的异常蛋白干扰风险，是目前基因敲除动物制备的发展趋势。  案例：Dcaf8基因完全敲除小鼠模型 需要注意的是，由于特定基因的基因组区域可能包含其他必要信息，在选择完全敲除这种模型构建方式时需要有专业的技术人员对目的基因的功能和基因组序列进行评估。