电子科技大学《分子生物学》课件-第8章核酸分子杂交.pptxVIP

1第8章 核酸分子杂交8.1 核酸杂交基本原理8.2 核酸探针技术8.3 核酸分子杂交技术8.4 基因芯片电子科技大学《分子生物学》 2核酸定性或定量检测基因克隆、突变及其表达研究疾病的临床诊断主要用途 38.1 核酸杂交基本原理核酸变性核酸复性核酸分子杂交 48.1.1 核酸变性变性（denaturation） ：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。 5 6DNA的变性因素凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。加热极端的pH有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等） 7变性DNA的理化性质溶液黏度降低：DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软” 无规则单股线性结构，DNA黏度明显下降。溶液旋光性发生改变：变性后DNA分子的对称性及局部构型改变。紫外吸收增加：DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强。双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸 8增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 9解链曲线通常利用DNA变性后在波长260nm处吸光度（A260）的增加来监测DNA变性的过程。如果以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。典型DNA变性曲线呈S型。 10融解温度融解温度（ melting temperature，Tm）：在热变性过程中，紫外吸收增加达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度。爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的融化现象，故名融解温度。狭窄性：变性温度范围很小。 11Tm的影响因素DNA分子大小和碱基的组成溶液的离子强度pH值变性剂 121、DNA分子大小和碱基的组成DNA的均一性碱基组成的均一性样品组成的均一性DNA的（G+C）含量 13DNA的（G+C）含量在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的（G+C）的含量。（G+C）含量越高，G-C 碱基对越多，Tm值越高。核苷酸≤20bp：Tm=4（G+C）+2（A+T） 14 152、溶液的离子强度溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，需要较高温度才能使DNA变性。离子强度较低时，Tm值较低，而且解链的温度范围也较宽。 163、pH值pH值影响氢键的形成。pH值在5-9范围内，Tm值变化不明显。pH值小于4或大于11时，均不利于氢键的形成，DNA容易变性。 174、变性剂干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂有甲酰胺、尿素、甲醛等。 188.1.2 核酸复性复性（renaturation）：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。退火（annealing）：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。双链DNA、RNA双链区、DNA: RNA杂交双链以及其它异源双链核酸分子都具有此性质。 19核酸复性的影响因素温度和时间DNA浓度DNA分子大小和复杂度离子强度 201、温度和时间一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温（如4℃以下），复性几乎是不可能的。 212、DNA浓度DNA复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”。“成核”速度与DNA浓度的平方成正比。溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。 223、DNA分子大小和复杂度用非重复碱基对（bp）数表示核酸分子的复杂性。简单顺序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。顺序复杂的DNA，如小牛DNA的非重复部分（一般以单拷贝存在于基因组中），这种复杂的特定序列要实现互补，显然要比上述简单序列困难得多。 234、离子强度对复性的影响增加盐浓度可增加互补链合成双链的速度，盐中和DNA单链中磷酸基团的负电荷，减少互补链静电排斥。 248.1.3 核酸分子杂交核酸分子杂交（molecular hybridization）:两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。 25杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。　　利用探针（probe）与靶DNA杂交，可识别靶DNA中的特异核苷酸序列。 265.2.2 核酸探针技术核酸探针（nucleic acid probe)：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测