分子克隆常用的DNA聚合酶.pptxVIP

分子克隆常用的DNA聚合酶;主要内容;（一）.基本概念: 1. 分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。 2. Dalton，bp，nt 道尔顿（Dalton，Dal，Da，D）：分子量的单位，蛋白质是大分子，所以常用kDa（千道尔顿）来表示。 碱基对（ bp）＝ base pair，1 kb就是1000个碱基对； nt＝核苷酸 nucleotide 。 ;（一）.基本概念;（一）基本概念;（一）基本概念;（一）基本概念; （一）基本概念; （二）分子克隆的基本过程 1.概述 （1）.分：得到目的基因 （2）.切：将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割。 （3）.接：将目的基因和载体连接，形成重组子。 （4）.转：将重组子转到适当的宿主细胞中。 （5）.筛：筛选出含有正确重组子的宿主细胞，扩增。; （二）分子克隆的基本过程;分类 （1）. 使核酸降解的核酸酶类： 核酸内切酶、核酸外切酶。 （2）.催化核酸合成的酶类： DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。 （3）. 核酸修饰酶类； 甲基化酶，激酶，基团转移酶， 磷酸酶等。 ;（1）. 使核酸降解的核酸酶类：; 是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。;Ⅲ .限制性核酸内切酶的分类：;Ⅱ型限制性内切酶实际应用价值最大，这是因为： ① Ⅱ型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰活性； ② 对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确； ③ 此类酶作用时只需要Mg2+参与。无需ATP。 因此Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。;Ⅳ ．限制性内切酶的命名 目前已广泛采用H．O．Smith和D．Nathams于1973年提出的命名系统：限制性内切酶第一个大写字母——来自细菌的属名(genus)，第二、三个小写字母——来自种名(species)，??四个字母代表菌株(strain)：如果从一种菌株中发现了多种限制酶，则根据发现和分离的顺序用罗马字母表示。例如从流感嗜血杆菌D株中分离到的限制酶分别表示为Hind I、Ⅱ、Ⅲ，EcoR I。;Ⅴ.限制性内切酶的作用特点： ①有严格的识别、切割的DNA序列，并以内切的方式水解双链DNA分子中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。 ②识别序列一般为4～6个碱基对，并以切割序列的正中作为轴心，成180°反向重复(inverted repeat)。这种结构也称为回文结构(palindrom)。 ;③切割后产生平头或粘性末端。 ④Ⅱ型RE酶只需Mg2+， 不需ATP。 ;限制性内切酶(Restriction Endonuclease);第20页/共91页;?? Ⅵ.限制性内切酶使用时的注意事项;⑤.在酶反应缓冲体系中均添加有二硫苏糖醇或β-巯基乙醇，以稳定酶活性防止氧化。 ⑥.在具体试验操作时应在低温或冰浴条件下完成。;2.分子克隆中常用工具酶;Ⅰ．DNA聚合酶I：;DNA聚合酶I作用条件：;Ⅱ.TaqDNA聚合酶;TaqDNA聚合酶的应用;Ⅲ.DNA连接酶：;大肠杆菌的DNA连接酶;①．T4噬菌体DNA连接酶;特点：;②．大肠杆菌DNA连接酶;Ⅳ.反转录酶：;反转录酶的作用特点：;③此酶缺乏起校正作用的3’-5’ DNA核酸外切酶活性，催化的聚合DNA反应会产生一定的错配率。 ④常用的逆转录酶有禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶和Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶 。 ;Ⅴ.末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶);末端脱氧核苷酸转移酶的作用： 末端转移酶常用于给载体或cDNA加上互补的多聚尾巴，构建人工粘性末端；也用于DNA分子3’端标记。;Ⅵ .碱性磷酸酶：;碱性磷酸酶应用：;第40页/共91页;（二）分子克隆的基本过程;⑴载体必须具备以下基本条件： ;⑴载体必须具备以下基本条件：;⑵.质粒载体：;⑵.质粒载体：;Ⅰ质粒的特点： ;遗传选择标记： ;四环素抗性(tetracycline resistance，tetr)基因：该基因编码一种膜相关蛋白以阻止四环素进入细胞。 不同的质粒具有不同的抗药基因，质粒的ampr、tetr基因若被外源基因插入而失活，就失去了耐药性，因此抗药基因常作为基因工程的筛选标