凝胶过滤层析法纯化牡蛎碱性磷酸酶.pptxVIP

凝胶过滤层析法纯化牡蛎碱性磷酸酶;一、目的要求;色谱的历史知识 层析 色谱 Chromatography 茨维特（Mikhail Tswett，俄国植物学家），1901年，植物色素分离 1952 年，James 和Martin 发明了气相色谱，获得1952 年的诺贝尔化学奖 用于生物分子分离分析的色谱技术 液相色谱（常压液相色谱、高压液相色谱-HPLC）、吸附色谱（柱色谱、薄层色谱）、离子交换色谱、亲和色谱、金属螯合色谱（“镍柱”）、排阻色谱（凝胶色谱） ;二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。;;优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶 ;第7页/共24页;凝胶及柱的选择 ; ;装柱的两种方法： a.手工操作 1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法 （如图4-9） ;样品上柱 分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的10—20% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 ;四、操作方法;（二）装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约5cm高度柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。 （三）凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。 ;实验步骤 1、按图示排列将凝胶柱及各仪器连接好。 （1）凝胶柱的出水口与紫外检测仪的进水口（打“?”符号者）连接，通过软管将紫外检测仪的出水口（打“⊙”符号者）与部分收集器连接； （2）用红、黑两条连接线将紫外检测仪与记录仪相连接—“红接红”、“黑接黑”； 2、依次打开紫外检测仪、部分收集器、记录仪开关，对仪器进行预热。 3、通过“量程/零位”切换开关，设定记录仪的量程为“10mv”，取下记录笔的笔套，检查记录笔是否可书写。;4、转动紫外检测仪右侧板上的波长旋钮，设定检测波长为280nm。 5、打开凝胶柱出水口的夹子，使洗脱缓冲液流经检测器。把“灵敏度”旋钮选择到“100%”档，调节“光量”旋钮，使检测仪窗口数字显示为100，即透光率为100%。再将“灵敏度”开关转到“0.5A”档，缓慢调节“调零”旋钮，检测仪数字显示为“0”，并使记录仪指针在“0”位。以上步骤需反复调节几次，待层析系统平衡后，即可加样检测。 （注意：在样品检测的过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮！） 6、完成以上步骤后，进行流速检测，记下凝胶柱中洗脱液流出2ml所需的时间，并以此时间对部分收集器进行定时。;7、部分收集器的使用： （1）按下“手动/自动”键，使收集器处于“手动”状态，在此状态下设置定时时间； （2）按“选择”键，每按一次移动一位，根据第6步的结果设定定时时间。当数字闪烁时，可通过“置数”键设置该位的时间，时间设定后再按一次选择键，即完成定时时间的设定。 （注意：定时的时间单位为分钟，即本型号仪器的最小定时时间为1分钟）;8、加样检测 （1）打开驻上端的螺丝帽塞子，用滴管吸出层析住中多余的溶液直至液面与胶面相切。 （2）沿着柱管壁将1ml碱性磷酸酶样品小心加入到凝胶床面上（注意不可将凝胶胶面冲起），打开出水口夹子，使样品溶液进入胶面内，直同时收集流出液，至液面与胶面相切时，将出水口夹紧。 （3）按上述加样的操作，以洗脱缓冲液洗涤柱管壁两次，每次1ml。最后加入3-4ml洗脱缓冲于凝胶柱中，重新装上上口螺丝帽，柱进水管与架上洗脱液试剂瓶相连。 （4）打开凝胶柱出水口的夹子，使已设定好定时收集时间的部分收集器处于自动收集状态，并开动记录仪进行记录。记录仪走纸速度设定为2mm/min。;五、注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此凝胶。 3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶