分子生物学实验课解析.pptxVIP

分子生物学实验课解析第1页/共58页第2页/共58页概 述 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此基因克隆又称分子克隆、基因操作或重组DNA技术。第3页/共58页概 述基因克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等基因克隆可概括为∶分、切、接、转、筛。第4页/共58页第5页/共58页　质　粒质粒（plasimid）是独立于染色体以外的能自主复制的共价、双链、闭合、环状DNA分子。主要存在于细菌、真菌、放线菌中。第6页/共58页质粒具有复制能力、转移性及选则标记等基本特性，携带外源基因进入细菌中扩增或表达。质粒DNA的分离与纯化是最常用、最基本的分子生物学实验技术。第7页/共58页实验一 质粒DNA的分离纯化第8页/共58页【实验目的】了解提取质粒的原理。学习和掌握质粒提取的方法和技术。 ——三个基本步骤：细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒DNA的释放质粒DNA的分离纯化第9页/共58页【实验原理】 裂解法：基于细菌染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异。第10页/共58页【试剂与器材】超净工作台恒温摇床高速离心机量筒、三角瓶、平皿、EP管、枪头、LB培养基溶液I 溶液Ⅱ 溶液Ⅲ TE(pH8.0)第11页/共58页【实验步骤】细菌的生长和质粒的扩增?菌体的收集裂解及质粒DNA的释放?质粒DNA的分离纯化第12页/共58页细菌的生长和质粒的扩增取一环冷冻保存的菌种（含pUC19）接种于LB固体平板（含Amp）上，倒置37℃过夜?取单个菌落，接种于3-5mlLB液体培养基（含50?g/mLAmp）中，37℃振荡过夜第13页/共58页菌体的收集裂解及质粒DNA的释放取5 ml菌液于生化管中，4500rpm 5min，弃上清用STE液加至生化管2/3处，漂洗沉淀， 4500rpm 5min用STE液1.5ml转入EP管，12000rpm 5min?加200uL冰预冷溶液I（强烈振荡混匀完全分散菌体）?加400uL溶液Ⅱ，快速温和颠倒EP管4-6次，冰浴5min，（溶液变黏稠）?加300uL冰预冷溶液Ⅲ，温和颠倒混匀，冰浴5min，（白色絮状沉淀）?12000rpm，5min，上清转至新EP管第14页/共58页质粒DNA的分离纯化加等体积氯仿（振荡混匀），12000rpm 5min, 上层水相转至新EP管，重复一次?加1/10体积3mol/L NaAc和2.5倍体积无水乙醇（充分混匀），-20℃ 10min，12000rpm 10min，弃上清?加1ml预冷70%乙醇（轻弹混匀），12000rpm 5min,弃上清将EP管倒置于滤纸上，室温敞口，10-15min?加入50?lTE，溶解沉淀，待用第15页/共58页注意事项 1.加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；2.加溶液Ⅱ裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核酸变性；3.加溶液Ⅲ后pH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开。4.酚-氯仿抽提离心后，小心吸取上清，勿吸有机相。第16页/共58页溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L Tris·Cl (pH8.0)10 mmol/L EDTA (pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。 作用：分散菌体，鳌合金属离子使金属失活第17页/共58页溶液 Ⅱ 0.2mol/LNaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。第18页/共58页溶液Ⅲ 5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L作用：酸性条件下质粒DNA复性，染色体DNA不能复性沉淀，高分子RNA沉淀。钾离子与SDS、蛋白质、膜形成复合物。第19页/共58页实验二 核酸的浓度和纯度测定与DNA的限制性酶切反应第20页/共58页【实验目的】了解：紫外分光光度法测定核酸浓度和纯度及 DNA限制性酶切反应的原理。掌握：核酸浓度和纯度的测定及DNA限制性酶 切反应的方法和技术。第21页/共58页【实验原理】紫外分光光度法测定核酸浓度和纯度：组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长是260nm，在260nm波长的紫外线下，1个吸光度值相当于双链DNA浓度为50ug/mL；单 链DNA或RNA为40ug/m