二维电泳的蛋白质提取制备.pptxVIP

二维电泳的蛋白质提取制备第1页/共51页第2页/共51页样品制备原则尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解样品裂解液应该制备，并且分装冻存-80℃，勿反复冻融已制备好的样品通过超速离心清除所有的杂质加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白第3页/共51页第一节细胞裂解方法温和裂解方法剧烈裂解方法用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解蛋白沉淀步骤清除影响二维电泳图谱杂质裂解液组分第4页/共51页一、温和裂解法组成较简单样品渗透裂解血细胞、组织培养细胞低渗溶液悬浮细胞冻融裂解细菌、组织培养细胞液氮迅速冷冻细胞，随后在37 ℃融化，反复几次第5页/共51页去污剂裂解组织细胞溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物酶裂解法消化细胞壁溶菌酶 细菌纤维素酶、果胶酶 植物溶细胞酶 酵母在等渗溶液中处理细胞第6页/共51页二、剧烈裂解法超声裂解法细胞样品通过切应力裂解细胞迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却弗氏压碎器（French Pressure cell）含有细胞壁的微生物在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力第7页/共51页研磨法固体组织、微生物冻存于液氮中，随后研磨成粉末机械匀浆法固体组织将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液玻璃珠匀浆法细胞悬液、微生物剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁第8页/共51页三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解蛋白酶抑制剂鸡尾酒（protease inhibitor cocktail）苯甲基磺酰氟 (Pheylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)：不可逆的抑制剂，使用浓度为1mmol/L?，抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中迅速失活AEBSF ：丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L?，AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低，AEBSF可能改变蛋白的等电点第9页/共51页EDTA，EGTA：使用浓度为1mmol/L，通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。多肽蛋白酶抑制剂：使用浓度为2-20ug/ml ? 亮抑酶肽（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑酶肽（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基多肽酶第10页/共51页甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCk），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPC）K：使用浓度为0.1-0.5mmol/L?，不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶苄脒（Benzamidine）：使用浓度为1-3mmol/L?，抑制丝氨酸蛋白酶第11页/共51页四、蛋白沉淀步骤1、硫酸铵沉淀（盐析）原理：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中步骤：蛋白浓度大于1mg/ml，缓冲液浓度大于50mmol/L，并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10~30min，通过离心沉淀蛋白只能预分离或富集蛋白，残存的硫酸铵会干扰等电聚焦硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用 第12页/共51页2、三氯醋酸（TCA）沉淀原理 ① 在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐② 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团, 使之聚集沉淀第13页/共51页2、三氯醋酸（TCA）沉淀原理③ 随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA 可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显④ 电泳图谱显示，BSA 、HSA 单体谱带有较明显的展宽现象，这可能是由于TCA 的结合，使SDS 与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致第14页/共51页2、三氯醋酸（TCA）沉淀有效的沉淀方法：将TCA加到提取液中，终浓度高达10~20%，冰上沉淀30min；组织样可直接用10~20%TCA进行匀浆；最后用丙酮清洗沉淀，以除去TCA蛋白质再溶解很困难，且不能完全再溶第15页/共51页3、丙酮沉淀沉淀机理：降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出优点：分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤较为容易在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性 第16页/共51页4、在丙酮中用TCA沉淀两者联合更加有效10%TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液(含有0.01%β-巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT)，至少-20℃沉淀45min仍然存在难再溶现象第17页/共51页5、用苯酚提取，随后在甲醇