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分子生物学常用技术杂交;分子杂交技术;（一）DNA变性 DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成 单链无规则线团样DNA，称为DNA变性。 变性方法：1): 加热、 2): DNA溶液的pH改变、 3): 有机溶剂等 变性的DNA的特征：粘度下降、沉降速度增加、 浮力上升、紫外吸收增加。 （二）DNA复性 变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结 合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。复性 后的DNA，理化性质都能得到恢复。 ;第4页/共79页;第5页/共79页;核酸分子杂交的特点: 高度特异性 高度灵敏性 已成为分子生物学中最常用的基本技术. 广泛应用于: 基因克隆的筛选 酶切图谱的制作 基因序列的定量和定性分析 基因突变的检测等。;杂交的双方 : 待测核酸序列 +探针（probe） 待测核酸序列: 克隆的DNA片段 未克隆化的基因组DNA 细胞总RNA, mRNA。; 核酸探针：是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记而便于检测的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。 基因组DNA探针 cDNA探针 寡核苷酸探针 RNA探针等 ;1、DNA探针 　　DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针种类很多: 有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。;２、cDNA 探针 　　cDNA （complementary DNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对） 。 无内含子和非编码序列 cDNA 探针是目前应用最为广泛理想的一种探针。;DNA探针（包括cDNA探针）的优点： 　　 ①: 这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖、大量制备、方法简便。 　　②: 不易降解（相对RNA而???），DNA酶活性一般能有效抑制。 　　 ③: DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。;3、RNA探针： 　　RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高,特异性强。 克隆载体体外转录(in vitro transcription) RNA探针 容易降解;4、寡核苷酸探针： 　　 根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，亦可作为探针使用。若不知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼并性。多用于克隆筛选和点突变分析。 　　 人工合成的寡核酸探针有下述优点： 　　①短的探针比长探针杂交速度快、穿透力强。 　　②可以在短时间内大量制备。 　　③在合成中进行标记制成探针。 　　④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。 　　⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。 ;人工合成的寡核酸探针有下述优点： 　 ①短的探针比长探针杂交速度快、穿透力强。 　　②可以在短时间内大量制备。 　　③在合成中进行标记制成探针。 　　④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。 　　⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。 ;　筛选寡核苷酸针的原则 ： 　　 ①长18～50bp，较长探针杂交时间较长合成量低；较短探针特异性会差些。 　　②碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。 　　③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结