生物化学教学课件：第五章 核酸化学.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * 片段越大，复性越慢。 浓度越大，复性越快。 变性的两条呈单链状态的DNA，经复性又重新形成双螺旋结构时，其溶液的A260值比复性前减小，（最多可减小至变性前的A260）这种现象称为减色效应（hypochromic effect) 。 五、核酸的提取 1、质粒DNA的提取 是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1~n个） 　　　　　　　松弛型复制（20个以上） 宿主染色体DNA与质粒DNA主要区别： 宿主染色体DNA 质粒DNA 分子大小 分子大 分子小 抽提结果 断裂成为线状 共价闭合环状结构 常用的质粒载体 是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19(500~700） Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 DNA克隆的策略 质粒的用途 ——重组克隆的载体 把一个目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中最常用的载体。 提取质粒DNA的方法 　从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法 煮沸法 SDS法 羟基磷灰石层析法 　各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。 ⑴ 培养细菌 在含有相应抗性的液体培养基中培养已转染质粒的细菌，使细菌快速增殖的同时质粒DNA得到大量扩增。目前常用的质粒均具有很高的拷贝数。 37oC 振荡过夜 分离质粒DNA包括3个基本步骤： ⑵ 裂解细菌以及质粒的初步分离 最普遍采用的方法是SDS-碱裂解法。将细菌培养物离心并以缓冲液悬浮，加入SDS溶液破坏细胞，再加入钾离子沉淀SDS与大分子DNA并离心去除，小分子的质粒DNA即处于上清液中。 细菌沉淀 SDS-碱 变性质粒DNA 变性染色体DNA、蛋白质 酸、钾 上清复性的质粒DNA 沉淀的变性染色体DNA、蛋白质 进一步纯化 2、基因组DNA的提取 在基因工程和蛋白质工程中，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。 破碎细胞 提取 纯化 沉淀法 介质吸附法 基因组DNA提取流程 六、核酸的分析技术 1、PCR技术—polymerase chain reaction PCR的设想 本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆目的片段”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件---模板DNA,引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系;DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR的基本原理 DNA的复制 (replication) —— 由亲代DNA合成两个相同的子代 DNA的过程。 亲代DNA 复制 子代DNA 在模板、引物、4种dNTP和Taq DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。 基本步骤 变性：加热使双链DNA变为单链 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应 2、反转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR） (1)反转录 1970年Trmin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶，该酶以RNA为模板，根据碱基互补配对原则（其中U与A配对），合成与RNA互补的DNA序列。因这一过程与一般转录步骤恰好相反，故称为反转录。催化此过程的DNA聚合酶叫反转录酶（reverse transcriptase）. 简单地说，反转录就是有mRNA到cDNA的过程。 （2）RT-PCR原理 不同来源，但具有互补序列的两条DNA或RNA单链，按碱基配对原则结合在一起，此过程称为杂交或分子杂交。 杂交可在DNA-DNA片段之间，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之间进