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分子实验技术 第1页/共43页 2 第一节、重组DNA技术-基因工程 第二节、分子杂交及相关技术 第三节、聚合酶链反应的原理和应用 第四节、基因定位的常用方法 第2页/共43页 3 分子生物学技术 70年代以来,分子生物学技术迅速发展起来,使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究,分析其功能特征,了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。 第3页/共43页 4 1946 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 1944DNA是遗传物质 1949Hbs贫血 1953双螺旋 1956HbsGlu-Val 1966遗传密码 第一个R酶 1972重组质粒 1975DNA杂交 1977DNA测序 1981转G小鼠 1983HD病G定位 1985PCR 1986位置克隆 1987G剔除小鼠 1989位置克隆 1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列 1996酵母基因组序列 现代分子遗传学发展 重要事件 第4页/共43页 5 第一节 重组DNA技术-基因工程 重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。 第5页/共43页 6 一、限制酶 限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 第6页/共43页 7 1、限制酶的命名 根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。 第7页/共43页 8 2、限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。    如：Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’   Bam HI 5’-GGATCC-3` 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 　　 切割形成 粘性末端（sticky end）交错切。 第8页/共43页 9 第9页/共43页 10 部分常用限制酶及切点 第10页/共43页 11 互补末端连接 第11页/共43页 12 产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式： 1)用同一种限制酶切割； 2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割； 3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。 第12页/共43页 13 3、特点： 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途： 1) 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。 2) 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。 3) Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。 第13页/共43页 14 二、基因运载体及其选择 载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 第14页/共43页 15 载体具以下特征： 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖； 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。 常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。 第15页/共43页 16 （一）.质粒plasmid  Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。