实验一鸡卵类粘蛋白的分离与纯化.pptxVIP

实验一鸡卵类粘蛋白的分离与纯化;实验一 鸡卵类粘蛋白的 分离与纯化;【目的要求】;【学科知识点】 ;实验内容 ; 鸡卵黏蛋白是一种糖蛋白，存在于鸡蛋清中，在10％三氯乙酸或50％丙酮溶液中有较好的溶解度。选择合适的pH值，三氯乙酸浓度和丙酮浓度，可以从蛋清中获得鸡卵黏蛋白的粗提液。;【操作步骤】; 2) 4h后, 3000r/min离心10min 。收集上清液，再用滤纸过滤，除去上清液中脂类物质及其它不溶物。滤液量体积，转入500 mL烧杯内，缓慢加入3倍体积冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，置冰箱放置2h。; 3)小心虹吸出部分上清液，剩余部分全部转移到离心管里，经平衡后以3500r/min 离心10min，弃清液，沉淀物放在真空干燥器内，抽气除去残留丙酮。; 蛋白质混合溶液在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质沿颗粒间的空隙以较快的速度流过凝胶柱，最先流出柱外。而盐或其他小分子物质因进入凝胶颗粒的微孔中向下移动的速度较慢，所以最后流出柱外。因此通过凝胶层析可以达到除去小分子物质的目的。;; 1）凝胶的处理 量取100mL Sephadex G-25凝胶，加入200mL磷酸盐缓冲液，沸水浴中1h。上柱前用真空干燥器抽气。; 3）平衡 打开核酸蛋白检测仪、记录仪电源，将柱出水口与核酸蛋白检测仪比色池进液口相连，开启柱口下夹子，用约2倍体积的pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。直至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线。;;; 4)上样 取样品溶解液上Sephadex G-25层析柱。控制流速15d/ min，收集蛋白峰。即可得到鸡卵类黏蛋白粗提液。并准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。;第17页/共26页;【基本原理】;; 4) 洗脱 改用含0.3mol/LNaCl的pH6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰。; ;; ; ; ;感谢您的欣赏