二代测序文库构建 罗氏诊断罗博士.pptxVIP

Fredrick Sanger and his first generation sequencing –ddNTP chain-termination method.PCR, invented by Kary Mullis,becomes the foundation ofsequencing.James Watson FrancisCrick discovered DNAstructure.NanoporeMinionPacBio Sequel3-generation sequencingrealizes high-throughputand long read-lengthsequencing – 3GSsequencers (PacBio,Nanopore, etc.)Sanger sequencingautomation solution – CEsequencer (ABI 3130,3730, 3500 etc.)Next-generation sequencingrealizes high-throughput andlow cost sequencing – NGSsequencers (Illumina, IonTorrent, SOLiD, 454, etc.)NGS libraryPPi桥式PCR - 成簇反应NGS library可逆终结子 - 边合成边测序NGS library液滴PCR电位计 - 半导体测序NGS library片段化、修饰及环化滚环扩增 (RCA)?????DNA纳米球 (DNB) 形成DNB阵列加载cPAS测序反应 (类似SBS)建库到底是在干什么？④①①④③②②双端标签文库① 与流动槽（Flow Cell）结合的区域② Read 1和Read2测序引物结合的区域③ 插入片段④ 标签序列区域（Index）文库制备的目的是在需要测序的DN 片段两端加上能够与测序仪配合的接头序列（Multiplexed, SR, P ）测序分析文库定量质控靶向富集原始样品收集样品富集核酸提取核酸定量质控文库制备? 片段化? mRNA富集，rRNA去除（可选）? 片段化? 反转录（一、二链合成）? 加A加接头? 扩增? 末端修复? 加A加接头? 扩增（可选）DNA建库RNA建库Genomic DNAFragmentationEND repairClean-up or Size selectionClean-upA-tailingClean-upAdapter ligationClean-up or Size selectionPCR amplification(Optional)Clean-up or Size selectionNGS library? 物理打断? 液体剪切力（HydroShear）强 大弱 小? 氮气（Nebulization）? 聚焦声波（Covaris）? 超声（Bioruptor）? 酶切片段化? 转座酶（Nextera）? 混合酶（KAPA, NEB）? 末端补平? 将粘性末端补平，使片段化后的DNA变为平末端? Klenow酶用于双链DNA 5突出末端的补平(fill-in)；? 双链DNA 3突出的打平(也称削平)? PNK酶磷酸化5’端? 加A尾? 在所有平末端DNA的3’端加上一个A碱基? 能够有效防止接头二聚体和多连体的形成? 在连接酶作用下，测序接头与DNA片段进行TA连接? 常见的Illumina接头如下图左上角所示，为Y型接头? 右图为NEB Ultra所采用的环形接头，需要在后续PCR过程中加上测序所需的部分序列（P5、P7以及index（BC））Clean-up or Size selection? 片段筛选? 利用磁珠进行片段筛选是目前的主流方法? 也可用切胶回收的方法进行? PCR扩增? 目的性富集两头均成功连接上接头的片段Total RNAEnrichment (polyA+/rRNA-)FragmentationEND repairA-tailingAdapter ligation1st strand synthesis2nd strand synthesisPCR amplification(Optional)NGS library1) RNA经热和镁处理碎片化, 随机引物退火2) 第一条链合成过程中，引物延伸3) 第二条链合成过程中, Uracils插入从而“标记”链UUUUUUU U U U U U U U U4) dAMP 被添加到 3’端，促进连接AAU U U U U U U U UU U U U U U U U U5) 连接接头AAU U U U U U U U UU U U U U U U U U6) 由于Uracils的存在