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第1页/共33页生物色谱技术第2页/共33页因为有同学没有学习过色谱，我们大概介绍一下色谱技术的起源。色谱技术最初就是俄国的植物学家茨维特发明的。1906年，茨维特在研究植物色素的过程中，做了一个经典的实验：在一根玻璃管的狭小一端塞上一小团棉花，在管中填充沉淀碳酸钙，这就形成了一个吸附柱。然后将其与吸滤瓶连接，使绿色植物叶子的石油醚抽取液自柱中通过。结果植物叶子中的几种色素便在玻璃柱上展开：留在最上面的是两种叶绿素；绿色层下面接着叶黄素；随着溶剂跑到吸附层最下层的是黄色的胡萝卜素。这样吸附柱成了一个有规则的与光谱相似的色层。然后把该潮湿的吸附柱从玻璃管中推出，依色层的位置用小刀切开，于是各种色素就得以分离。再用醇为溶剂将色素溶解出来，即得到了各成分的纯溶液，由此实现了色素的分离和制备。1903年，他将这一研究成果发表在华沙的《生物学杂志》上，这就是有关色谱法的第一篇研究论文。但当时他用俄文写的报告未能引起人们的兴趣，一直到他死后威尔施塔特重新介绍了这种方法时，他的工作才受到了人们的注意。第3页/共33页色谱法 Chromatography Inventor M. S. Tswett(茨维特) 1903 – Mikhail Tswett defines the Science of Chromatography 第4页/共33页生物色谱法 生物色谱法（Biochromatography）是20世纪80年代中后期问世，由生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术。亲和色谱法固定相和研究对象都是生物大分子细胞膜色谱法固定相含有生物大分子常规色谱法研究对象是生物大分子第5页/共33页细胞膜色谱 Cell Membrane Chromatography, CMC 将细胞膜结合到硅胶表面，制成细胞膜固定相，利用色谱学技术研究流动相中药物与受体相互作用规律的受体动力学新方法。特点：分离 + 活性筛选 合二为一 适合于天然药物活性成分的筛选及药物作用机理的研究。第6页/共33页举例α1A肾上腺素受体高表达细胞膜色谱 aa：酚妥拉明bb：5-羟色胺c：甲氧明d：羟甲唑啉cd第7页/共33页亲和色谱Affinity Chromatography，AC 利用生物大分子具有对某一类生物大分子特异性识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。载体配体亲和识别 ： 抗体-抗原 酶-底物 激素-受体第8页/共33页IgG蛋白第9页/共33页亲和色谱分离原理1. 找与底物专一可逆结合的配体, 将配体通过共价键偶联到载体。2. 配体与目标物吸附；3. 洗脱目标物；4. 亲和柱再平衡。第10页/共33页亲和体系特异性亲和体系高特异性抗原－抗体荷尔蒙－受体蛋白核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白酶－底物、产物、抑制剂群特异性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－辅酶凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质－肝素酶、蛋白质－活性色素（染料）酶、蛋白质－过渡金属离子（铜、锌等）酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）第11页/共33页核酸结合蛋白第12页/共33页A蛋白葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA) 从A型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分离而得的一种细胞壁蛋白。可与人类大多数类型的IgG(IgG3除外)的Fc段结合，但很少或几乎不与人类的IgM结合。用于免疫分析和IgG的提纯。免疫球蛋白?A（immunoglobulin A， IgA） 已有研究证明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影响呼吸道粘膜对病原体的抵抗力，两者呈正相关。1. 与病毒或细菌毒素结合，从而阻止它们进入或破坏细胞；2. 附着在细菌的鞭毛上，让其活动性减弱，并且更容易被巨噬细 胞吞噬.第13页/共33页亲和色谱纯化抗体原理第14页/共33页亲和色谱分离示意图第15页/共33页亲和色谱的固定相间隔臂载体固定相配体1. 载体 （support，又称基体matrix）无机氧化物：SiO2、Al2O3、ZrO3生物聚合物：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖、葡聚糖等。 特性① 亲水但不溶于水，可溶胀；③ 化学性质稳定且易于改性；② 大孔且有一定的机械强度；④ 表面积很大但呈现惰性；第16页/共33页亲和色谱的固定相2. 配位体 （ligand，又称底物 substrate）专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度特异性配体生物素－亲和素、抗原－抗体、酶－抑制剂、激素－受体通用性配体凝集素－各种糖蛋白，核酸－RNA、RNA－蛋白质第17页/共33页亲和色谱的固定相3. 间隔臂 （spacer或spacer arms）① 脂肪族有机物或多肽、蛋白组