DB32-T 3762.13—2021新型冠状病毒检测技术规范 第13部分：叠氮溴化丙锭-荧光PCR检测程序.docxVIP

DB32/T 3762.13—2021 PAGE 3 新型冠状病毒检测技术规范 第13部分：叠氮溴化丙锭-荧光PCR检测程序 范围 本文件规定了新型冠状病毒叠氮溴化丙锭-荧光PCR（PMA-qRT-PCR）检测环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、样本处理与核酸提取、扩增体系配制与扩增和结果判断。 本文件适用于新型冠状病毒PMA-qRT-PCR检测，为判断样本中的新型冠状病毒是否具有感染性提供辅助手段。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。 DB32/T 3762.3 新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 医疗机构临床基因扩增管理办法 原中华人民共和国卫生部办公厅 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 原中华人民共和国卫生部检验中心 术语和定义 叠氮溴化丙锭 propidium monoazide；PMA 一种具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料，光解后，染料上的光敏叠氮基转变为高反应性的氮烯自由基，极容易与结合部位核酸的碳氢化合物形成牢固RNA或DNA修饰，修饰后的核酸不能用作PCR反应模板被扩增。由于PMA不能透过活细胞膜，因此将PMA与PCR联合使用可用于区分死活细胞、细菌和病毒等。 环境与设施 同DB32/T3762.3第4章。 设备与耗材 BLU-V曝光系统或卤素灯（650 W），余同DB32/T3762.3第5章。 试剂与材料 试剂 病毒核酸提取试剂盒。 qRT-PCR扩增试剂盒。 二甲基亚砜（DMSO）。 磷酸盐缓冲液（PBS，PH=7.4）。 叠氮溴化丙锭（PMA）。 材料 新型冠状病毒核酸检测质控品。 消毒剂：75 %乙醇、有效氯5 500 mg/L的消毒液（需每天新鲜配制）。 试验技术要点 用于新型冠状病毒核酸PMA-qRT-PCR检测的样本应采用非灭活型病毒采样管进行采集。 样本前处理 在BSL-2实验室生物安全柜内打开样本第二层包装，取出待检样本，核对送检单，若管壁外有不明液体，应用消毒剂擦拭。 将样本混匀后分装于2 mL带螺旋盖内有垫圈冻存管。在冻存管上标记，注明姓名、样本类型、日期等。吸取部分样本进行样本PMA预处理与核酸提取。所有冻存管旋紧管盖后需用封口膜密封。 样本PMA预处理与核酸提取 样本PMA预处理 以20 %二甲基亚砜（DMSO）将PMA配置成2 mM浓度。 将 PMA加入到病毒样品中使其达到200 μM终浓度，同时取等量PBS加入到病毒样本中作为样品对照组，并做好标记。以同样的方法对新型冠状病毒核酸检测质控品（稀释到500拷贝/mL）进行处理。 将所有样品管混合均匀，室温孵育10 min。 孵育完成后使用BLU-V曝光系统或卤素灯（650 W，样品置于冰上，距离灯源20 cm）曝光15 min。 以上步骤均在避光条件下进行。 核酸提取 同 DB32/T3762.3 的7.2条。 扩增体系配制与扩增 将qRT-PCR扩增引物和探针（Forward：5′-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3′；Reverse：5′-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3′；Probe：5′-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG -BHQ1-3′）配置为10 μM浓度。 采用qRT-PCR扩增试剂盒，根据试剂盒说明书配置qRT-PCR扩增体系，反应体系中每一条引物的终浓度为0.2 μM，每个样品及新型冠状病毒核酸检测质控品均做3个重复，同时设立阴性对照。 在生物安全柜内加核酸模板，然后根据试剂盒说明书设定反应条件进行qRT-PCR扩增，共扩增40个循环。 在实验记录本记录加样位置和样本编号。 未用完核酸样本转入病毒样本专用专人保管冰箱。 阈值设定 阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。 质控标准 阴性对照结果为阴性。新型冠状病毒核酸检测质控品 PBS处理组出现典型 S 型扩增曲线，Ct值小于40，且质控品PBS处理组Ct值和PMA预处理组Ct值之间存在统计学差异（阴性结果Ct值记为40）；若以上对照不成立，此次实验视为无效。 结果判断 记录各组样品Ct值，阴性结果Ct值记为40。如果样品PMA预处理组Ct值和PBS处理对照组Ct值之间无统计学差异，则提示样品中的病毒具有感染性的可能性较大；如果PMA预处理组Ct值和PBS处理对照组Ct值之间存在统计学差异，则提示样品中的病毒无感染