DB22T 2988-2019白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定 ITS-RFLP法.docxVIP

ICS 65.020.20 B 05 吉 林 省 地 DB22 方 标 准 DB 22/T 2988—2019 白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定 ITS-RFLP 法 Verification of genuineness for Pleurotus tuoliensis and Pleurotus eryngii strain—ITS-RFLP 2019 - 05 - 27 发布 2019 - 06 - 17 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 I DB22/T 2988—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位：吉林省农业科学院。 本标准主要起草人： 温嘉伟、杨云贵、张维东、谭笑、黄枭、刘迎春、杨大海、滕星、姚丽影、谢 江波。 1 DB22/T 2988—2019 白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定 ITS-RFLP 法 1 范围 本标准规定了白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定ITS-RFLP法的原理、试验条件、试剂、设备仪器、样 品、试验步骤、试验数据处理、试验报告。 本标准适用于白灵菇和杏鲍菇菌种(母种、原种和栽培种)真实性检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8979-2008 纯氮、高纯氮和超纯氮 NY/T 1730-2009 食用菌菌种真实性鉴定 ISSR法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 ITS-RFLP internal transcribed spacer – restriction fragment length polymorphism 内转录间隔区-限制性片段长度多态性。 3.2 白灵菇 Pleurotus eryngii var.tuoliensis C.J.Mou 侧耳属，刺芹侧耳变种或亚种，子实体通体白色。(GB/T - 12728) 3.3 杏鲍菇 Pleurotus eryngii 又名刺芹侧耳，菌柄白色，菌盖灰褐色。 3.4 PCR 扩增 polymerase chain reaction 聚合酶链式反应。 4 原理 利用真菌内转录区域保守的引物 ITS1 和 ITS4，扩增真菌内转录区域， 然后对 PCR 产物进行酶切， 根据酶切片段大小对白灵菇和杏鲍菇菌种真实性进行鉴定。 5 试验条件 2 DB22/T 2988—2019 DNA提取、PCR反应体系配制、PCR扩增、电泳等功能区域应采取分区操作，避免交叉感染。 6 试剂与材料 除非另有说明，在分析中仅适用分析纯试剂和去离子水或相当纯度的水。 6.1 超纯水(ddH2O)：符合 GB/T 6682 规定的二级水，密封、4 ℃ 保存。 6.2 10 mol/L 氢氧化钠溶液： 在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠(NaOH) ，溶解后， 冷却至室温， 再加水定容至 200 mL。 6.3 500 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2 )溶液(pH 8.0) ：称取 18.6 g 乙二胺四乙酸二钠， 加入 70 mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(见 6.4)直至 EDTA-Na2 完全溶解，用氢氧化钠溶液(见 6.4) 调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa (121 ℃)条件下灭菌 20 min。 6.4 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL) 溶液(pH 8.0)：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲 烷溶解于 800 mL 水中， 用盐酸调 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL。在 103.4 kPa (121 ℃)条件下 灭菌 20 min。 6.5 1.5 mol/L 氯化钠(NaCL)溶液：在 160 mL 水中加入 17.6 g 氯化钠， 溶解后，冷却至室温， 再加水定容至 200 mL。 6.6 三氯甲烷(CHCL3 )：避光、密封、4 ℃ 保存。； 6.7 异戊醇(C5H12O)：避光、密封、4 ℃ 保存。 6.8 乙醇(C2H6O)：密封、室温保存。 6.9 dNTPs 混合溶液：将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等 体积混合。避光、密封、 -20 ℃ 保存。 6.10 高保真度的 Taq DNA 聚合酶、PCR 反应缓冲液及 25 mmol/L