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蛋白质复性的学习课件;提纲;1. 变性unfolding与复性refolding;复性有关理论;复性有关理论;复性有关理论;复性有关理论;复性有关理论;2.包含体的形成和性质;包涵体形成的几种可能性;减少包涵体形成的策略;包涵体形成：Advantages;3.包涵体的纯化和溶解;包涵体加工流程;包涵体的洗涤;包涵体的溶解;4. 蛋白质复性;影响复性效率的因素 ;3）变性剂浓度和复性时间 在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L 盐酸胍、8mol/L Urea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐酸胍和Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的疏水相互作用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用的形成。 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长的一段时间，I就可以慢慢地向N转化 4）氧化还原环境 复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形成S-S的环境→合适的氧化还原环境 采用配对的氧化型和还原型巯基物质 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基乙醇/胱氨酸等。通常还原型巯基物质的使用浓度为l~3mmol/L，还原型/氧化型的摩尔比为10：1或5：1。 ;5）pH和温度 最适宜的复性pH值应大于7.0（一般8.0-9.0），以防止自由SH-的质子化作用影响正确配对的S-S的形成。应避免在蛋白质pI处进行复性（蛋白质的静电排斥力几乎为零，相互间疏水作用区域就容易作用而形成A）。 温度过高，蛋白质的聚集将十分严重，低温下聚集和折叠反应都很慢，随着温度的上升二者的速度都加快→常在室温下进行 6）折叠促进剂 能够促进蛋白再折叠的化学物质统称为折叠促进剂，折叠促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、抑制肽链间的疏水相互作用。 应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活性剂、聚乙二醇PFG、L－精氨酸、抗体、分子伴侣等。 ;例：人?-干扰素的后处理工艺;例：人?-干扰素的后处理工艺;5.蛋白质体外复性的常用方法;蛋白质复性时聚集反应的抑制;聚集反应抑制剂的种类： 可促进蛋白质折叠的小分子添加剂，如盐酸胍或尿素，以及一些离液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺类化合物等。在非变性浓度下，是很有效的促进剂。 对于某些需要???因子才表现活性的蛋白质，辅因子、配基、或底物具有很好促进折叠的作用。Zn2+ 和Cu2+可稳定折叠中间体。浓度为0.5~1.0mol/L的L-精氨酸可大幅度提高折叠效率（使不正确折叠和二硫键不稳定）。 PEG促进折叠复性，PEG与复性中间体特异形成非聚集的复合物，阻止复性时疏水中间体的聚集，复合物折叠形成第二个中间体，并不再与PEG结合。天然蛋白质即由第二个中间体形成。在有PEG存在下的所有的折叠反应具有相同的速率，复性率与PEG的分子量及浓度相关。认为PEG的作用与分子伴侣的作用机理相似。 ;非离子型表面活性剂，尤其是离子型或两性离子表面活性剂。如 Chaps、Triton X-100、磷脂、十二烷基麦芽糖苷、磺酸甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用。不利是与蛋白质形成胶团，难以去除，影响后续的分离纯化。 多离子化合物，如肝素，可促进蛋白质的折叠复性，且有稳定蛋白质天然构型的作用。 短链醇类、高渗物，如乙醇、甘油等对蛋白质有稳定作用，可有效降低低聚体的形成。如胰岛素生长因子I的复性，除了在复性液中加入Cu2+和Mg2+、2mol尿素、盐类（1mol/L NaCl、DTT）外，还加入乙醇、甘油等。 单克隆抗体，待折叠复性的蛋白质的抗体可有效的协助其复性，但只有该蛋白质的特异抗体有效。它可与待折叠复性的蛋白质的远离活性中心的疏水区域结合，有效阻止无活性聚集体的形成。;分子伴侣和折叠酶，这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白、二硫键异构酶(PDI)、肽酰-脯氨酰顺反异构酶(PPI)、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质折叠复性。由于分子伴侣和折叠酶在蛋白质复性后要除去，且这类蛋白质又十分昂贵，须采用可回收的方法，如固定化方法。 人工伴侣，将变性蛋白质首先加到含表面活性剂的溶液中，以防聚集，然后用环糊精除去表面活性剂，促进折叠复性。这称为人工伴侣复性。;蛋白质复性时聚集反应的抑制;蛋白质复性时聚集反应的抑制;蛋白质复性的促进剂; ;由于凝胶基质微孔的体积排阻效应和减少的扩散效应，部分折叠的蛋白质之间的相互作用受到有效的阻挡 →降低了发生聚集的可能性 可溶性的聚集物、复性的蛋白、变性剂和氧化还原剂依次流出;固相复性（柱上复性）优缺点;展 望; 许多变性蛋白质在去除变性因素后，可自发地恢复它原来的空间结构和生物活性，这称为变性蛋白质的再折叠或复性。 包涵体：外源目的基因在宿