武理工水处理生物学实验指导03微生物的染色.docVIP

PAGE PAGE 10 实验三 微生物的染色 一.目的 1.学习微生物的染色技术，掌握微生物的单染色法和革兰氏染色法。 2.学习油镜的操作 二.实验器材 1.显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。 2.结晶紫染液、碘液、95%乙醇、沙黄染液。 3.菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。 三．实验原理 1.单染色法：微生物不但个体微小，且无色半透明。要在显微镜下观察清楚，必须染上颜色 。微生物细胞中含有大量的蛋白质等一类两性电解质：在酸性溶液中结合质子带正电；在碱性溶液中给出质子而带负电。等电点一般在pH=2~5。所以，在中性、碱性或弱酸性溶液中，微生物细胞通常带负电荷。碱性染料在电离时，染色部分是带正电荷的，容易与带负电荷的菌体结合使之着色。经染色后的菌体细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下很容易观察。 2.革兰氏染色法：革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。 四.实验方法及步骤 (一)单染色 1．涂片 在洁净的载玻片上先作上记号，以免弄错正反面。然后在其中央滴上一滴无菌水或生理盐水(0.85％NaCl)。用烧灼冷却过的接种环取少量菌体至玻片的水滴中,和匀后涂成均匀薄片。涂片面积不宜过大。下图说明从试管中采取菌体制备涂片的无菌操作过程。接种环用后必须再度烧灼灭菌。 2.干燥 在空气中自然干燥，使菌体的位置不再移动。 3．固定 涂片于酒精灯火馅中通过3~4次(以玻片与手接触面感到稍微烫手为度)、使菌体固定于玻片上而不易脱落；固定也可使标本容易着色。 4．染色 放标本于水平位置，在上面滴加结晶紫染色液。染色时间约1~2min。 5. 水洗 染色达到需要的时间后，倾去染色液，并以水冲洗，至冲下的水无色时为止。注意使水柱由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。 6．吸干 在空气中自然干燥，或用吸水纸吸干后，分别用低、高镜找到目标后用油镜观察。 （二）革兰氏染色 1．将实验所供菌种按单染色法作涂片、干燥并固定。 2．在涂面上，加草酸铵结品紫染色液一滴，约1~2min后，水洗；加碘液1min后，水洗。 4．斜置载玻片于一烧杯口之上，滴加95%酒精脱色，并轻轻摇动玻片，至流出的酒精不再显紫色时立即停止滴加(约滴加0.5—1min)，随即水洗。为了节约酒精，也可将酒精滴至涂片上，静置15~20s后水洗、吸干。酒精脱色程度必须严加掌握。如脱色过度，则阳性菌会被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌将被误染为阳性菌。 5．加沙黄（番红）复染液，1~2min后水洗。 6．吸干，分别用低、高镜找到目标后用油镜观察，阳性者为紫色，阴性者为红色。 四、思考题 1．微生物的染色原理是什么? 2．用单染法染色后看到的微生物是什么颜色? 3．你用革兰氏染色法染色后看到的细菌是什么颜色？属于革兰氏阴性还是阳性?革兰氏染色法在微生物学中有何重要意义? 4．革兰氏染色法中若只做1—4的步骤而不用沙黄复染液复染是否能分出革兰氏阳性菌和革兰氏阴性面，为什么? 5．微生物经固定后，是死了呢还是仍活着?