外源基因的表达.pptxVIP

外源基因的表达;第六章 外源基因的表达;基因工程技术的核心是基因表达技术。 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。;目前已构建出了多种基因表达系统，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。 在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时， mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。 在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。;6.1 基因表达的机制;6.1.2 mRNA的延伸与稳定;6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译;不同基因组使用密码子具有选择性。;6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性;6.1.5 目的基因沉默;6.2 基因表达的调控元件;6.2.1.1 原核生物的启动子;;6.2.1.1 真核生物的启动子;Ⅰ型启动子;Ⅱ型启动子;Ⅲ型启动子;6.2.1.3 启动子与转录启动;第19页/共131页;s factor:;6.2.1.4 启动子的分离;6.2.2 增强子;6.2.3 终止子;①本征终止子;②依赖型终止子;在RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着5’ 3’方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3’－OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录过程。终止过程需要消耗能量，所以， ρ因子有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。;6.2.4 衰减子;Low Trp;第29页/共131页;6.2.5 绝缘子;6.2.6 反义子; 复制水平的调节; 翻译水平的调节;6.3 外源基因表达系统; 原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：;6.3.1 大肠杆菌基因表达系统;6.3.1.1 大肠杆菌基因表达载体;大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：;（1）DNA复制及重组载体的选择系统;选择标记;大肠杆菌表达载体上一般都带有一个以上的抗生素抗性基因。表达载体上的抗药性基因赋予宿主特定的抗药性，使其能在抗生素的培养条件下正常生长。这样就可以筛除掉不含载体的宿主，同时保证载体在宿主中的稳定存在。在构建大肠杆菌表达载体的过程中，选择何种抗生素抗性基因，还必须考虑到是否会对特定宿主细胞的代谢活动产生影响。;（2）外源目的基因的转录系统;启动子位于基因的上游，其序列的长度因生物的种类而异。当RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动基因的转录。 启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用位点的特异性和种属特异性等特征。 在大肠杆菌细胞中大多数基因的启动子与转录起始位点间的距离为6～9bp，但对于要表达的外源基因来说，启动子与转录起始位点的最佳距离还有待实验来确定。;抑制物基因;转录终止子;（3）蛋白质的翻译系统;核糖体结合位点;SD序列与起始密码子之间的距离对保证准确和高效翻译也很重要。SD序列与起始密码子之间的距离一般为6～8bp，多数情况下为7bp，此间的碱基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率。 SD序列与起始密码子之间的碱基组成也影响翻译的起始效率。研究表明，SD序列后面的碱基为AAAA或UUUU时，翻译的起始效率最高，而当序列为CCCC或GGGG时，翻译的起始效率分别为最高值的50％和25％。 有的载体的启动子后接有SD序列，而另一些载体的启动子后没有接SD序列，那么则需要目的基因上游带进SD序列。 若在大肠杆菌中表达真核基因或本身所含核糖体结合位点较弱的原核基因，则必须从外部同时提供启动子和有效的核糖体结位点。;翻译起始密码子;在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止密码串连在一起。具报道，在大肠杆菌中以四个核苷酸组成的顺式序列UAAU作为终止密码，可有效地终止多肽链的合成。;6.3.1.2 宿主菌;6.3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统;6.3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式;包涵体的组成;融合蛋白;寡聚型外源蛋白;整合型外源蛋白;分泌型外源蛋白;②分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。 ③简化了发酵后处理的纯化工艺。;6.3.1.5 在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略;6.3.2 芽