树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究.pptxVIP

树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究第1页/共33页 树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究 第2页/共33页 研究背景第3页/共33页 HBV慢性感染主要原因HBV特异细胞免疫功能的低下T细胞 树突状细胞（DC）慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能异常研究背景（1）特异性CTL数量少低反应第4页/共33页 HBV慢性感染主要原因HBV特异细胞免疫功能的低下T细胞 树突状细胞（DC）慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能异常促进DC成熟、恢复DC的功能增强DC激活特异性抗病毒免疫反应打破免疫耐受彻底清除病毒研究背景（1）特异性CTL数量少低反应获得高频数、功能强HBV特异性的CTL第5页/共33页 促进DC成熟，增强DC功能CpGCD40LAd-IL-12转染Poly（I：C）关于恢复DC功能的研究研究背景（2）第6页/共33页 研究目的本研究通过在体外进行慢性乙型肝炎患者单核细胞的DC方向转化，并辅以聚肌胞Poly(I:C)刺激，增强DC的成熟和功能。将患者DC经HBV core18-27肽负载后，刺激病人自身的T淋巴细胞。并用Elispot法及本研究室构建的HLA-A2肽四聚体复合物检测病毒特异性T淋巴细胞的数量和功能。第7页/共33页 研究对象和方法第8页/共33页 研究对象22例HLA-A2+慢性乙型肝炎患者。HBeAg+患者16例、 HBeAb+患者6例。HBV DNA 均≥104 copy/ml。排除HCV、HAV、HDV、HEV感染。近半年没有接受过抗病毒治疗。第9页/共33页 研究方法HLA-A2型别鉴定 DC的体外培养扩增及鉴定 以树突状细胞为抗原递呈细胞体外诱导病毒抗原特异性T细胞 Elispot检测分泌IFN-γ的T细胞频数 MHC-肽四聚体检测 HBVcore18-27 肽特异性CD8 + T 细胞第10页/共33页 HLA-A*02型别鉴定 外周血淋巴细胞标记鼠抗人HLA-A02单抗；流式细胞仪检测；每份标本均设自身阴性对照。 第11页/共33页 树突状细胞的体外培养扩增及鉴定 分离病人PBMC；GM-CSF、IL-4 刺激下DC培养转化；Poly(?I:C)刺激；通过流式细胞仪检测DC的HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14等表面分子表达，进行功能及成熟度的鉴定。第12页/共33页 以DC为抗原递呈细胞体外诱导HBV抗原特异性T细胞 培养成熟DC负载HBV 核心肽（HBV core18-27 FLPSDFFPSV）；DC与自体T细胞共培养48-72h；单纯IL-2维持未经自身树突状细胞刺激T细胞组为对照。第13页/共33页 Elispot检测分泌IFN-γ的T细胞频数 封闭种板 孵育：37℃，5% CO2 孵育15-20 h；显色计数：CTL IMMUNOSPOT分析仪计数，取两复孔的平均值 第14页/共33页 MHC-肽四聚体检测 HBVcore18-27 肽特异性CD8 + T 细胞PE-HLA-A0201/HBVcore 18-27 tetramer 和FITC-鼠抗人CD8标记；流式细胞仪检测；慢性乙型肝炎患者，采用HLA-0201/HCV 四聚体标记作为阴性对照；第15页/共33页 统计学处理 实验数据以?x±SD表示。用SPSS10.0软件进行统计分析，组间比较用配伍组方差分析。 第16页/共33页 结 果第17页/共33页 DC的扩增、表型鉴定及Poly (I:C)对其表面分子表达的影响组别例数HLA-DR+CD80+CD83+CD86+CD14+CD11c+未加Poly (I:C)组2283.6 ±6.923.4±6.619.3±2.284.2±6.38.4±2.895.5±3.1Poly (I:C)作用组2288.8±7.839.3±8.6*30.7±5.6*85.4±3.23.7±2.3*93.4±2.9慢性乙型肝炎病人DC经Poly (I:C)作用前后表面分子表达的比较 *表示差异有统计学意义（P0.01）第18页/共33页 经Poly(I:C)刺激后： CD80、CD83表达明显上调。CD14的表达明显下降 。Poly(I:C)对DC表面分子表达的影响第19页/共33页 Elispot检测HBV特异性的分泌IFN-γ 的CTL细胞频数的比较 1 2 31.慢乙肝病人体外经IL-2维持生长的T细胞；2.经自体DC刺激后的T细胞；3.DC经Poly（I:C）作用后刺激的T细胞 第20页/共33页 树突状细胞激活的分泌IFN-γ的CTL细胞的频数分布图 T：慢性乙型肝炎患者体外经IL-