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第1页/共44页细胞培养基本知识第2页/共44页细胞培养基本知识第3页/共44页细胞室准备室：用于进行培养器皿的清晰、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等.缓冲间：为了减少将外界污染源头带入培养室培养室：是专门用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。第4页/共44页体外培养的设备和器具超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、液氮保存罐、离心机、水纯化装置、高压蒸汽消毒装置、酶标仪过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液器第5页/共44页超净工作台 利用鼓风机驱动空气通过高效空气微粒滤层净化后，徐徐通过工作台面，在操作区形成无菌环境。按气流方向的不同分为：1.外流式，2.侧流式第6页/共44页CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ① 使用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ② 保持培养箱内空气干净。定期消毒。 ③ 箱内灭菌蒸馏水3升，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。第7页/共44页自动双重纯水蒸馏器第8页/共44页培养器皿一次性培养瓶和培养板：一般朔料培养器皿的细胞生长面带负电荷，有利于大多数表面带正电荷的细胞贴壁生长玻璃培养瓶、溶液瓶、移液管第9页/共44页常用玻璃器皿清洗浸泡：在5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上，以达到软化器皿表面所附着物质，并中和器皿表面的碱性物质。刷洗：用软毛毛刷将浸泡后的其面在洗涤剂水中反复刷洗，以除去表面杂质。浸酸：利用强氧化作用清除器皿表面可能残留的有机物,时间在6小时以上最好过夜。冲洗：反复注满水、倒空达20次以上。最后用二次水浸洗2～3次，烘干后包装。第10页/共44页清洁液的配制第11页/共44页胶塞和塑料用品的清洗 先在水中浸泡，然后用2%NaOH溶液煮沸10分钟，自来水冲洗晾干后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟，最后分别用自来水和三次水各冲洗3次，烘干备用。第12页/共44页过滤除菌装置1.不锈钢板式滤器：2.微孔滤膜滤器：有可换膜式滤器和一次性滤器两大类。第13页/共44页细胞培养的概念原代培养：就是初次培养，即培养物一经接种到培养皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换生长器皿。它包括：细胞培养、组织培养、器官培养。传代培养：随着培养时间的延长、细胞分裂繁殖，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度逐渐减慢甚至停止，在这种情况下，都需要将培养物分割成小的培养。第14页/共44页原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代培养期衰退期第15页/共44页体外细胞培养物的生长类型贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。第16页/共44页每代贴附生长细胞的生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。其机制：接触抑制、密度依赖性。第17页/共44页第18页/共44页第19页/共44页传代的方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1. 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000 r/min）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2. 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3. 贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶第20页/共44页贴壁生长细胞传代方法1. 吸光培养瓶中的培养液,用PBS溶液清洗2-3次。2. 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5. 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7. 将后者放入培养箱中培养。第21页/共44页培养细胞生长的条件1. 细胞的营养需要2. 细胞的生存环境温度: 37 ℃O2CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-pH: 7.2-7.4渗透压 3 无污染 4 无毒第22页/共44页细胞培养用液水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl