DNA重组及重组DNA技术2.pptVIP

（三）目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 77 * 目前二十八页\总数六十四页\编于十二点 （四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 77 * 目前二十九页\总数六十四页\编于十二点 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 77 * 目前三十页\总数六十四页\编于十二点 质粒 (plasmid) 特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 77 * 目前三十一页\总数六十四页\编于十二点 77 * 目前三十二页\总数六十四页\编于十二点 λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 77 * 目前三十三页\总数六十四页\编于十二点 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒，杆状病毒） 其他 77 * 目前三十四页\总数六十四页\编于十二点 二、重组DNA技术基本原理 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 77 * 目前三十五页\总数六十四页\编于十二点 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 77 * 目前三十六页\总数六十四页\编于十二点 （一）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章) 77 * 目前三十七页\总数六十四页\编于十二点 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 77 * 目前三十八页\总数六十四页\编于十二点 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 77 * 目前三十九页\总数六十四页\编于十二点 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 77 * 目前四十页\总数六十四页\编于十二点 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 77 * 目前四十一页\总数六十四页\编于十二点 （二）克隆载体的选择和构建 目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。 77 * 目前四十二页\总数六十四页\编于十二点 （三）外源基因与载体的连接 粘性末端连接 77 * 目前四十三页\总数六十四页\编于十二点 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG