菊花种质资源离体保存技术规程.docxVIP

DB32/T XXXX—2019 PAGE 1 菊花种质资源离体保存技术规程 范围 本标准规定了菊花种质资源离体保存的术语和定义、基本要求和常温生长离体保存、低温生长离体保存、超低温离体保存方法及再生与检测方法等。 本标准适用于菊花种质资源的离体保存，菊属其他种质资源保存可参照执行。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1491 花卉植物病毒检测规程 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 常温离体保存 conservation at room temperature in vitro 在常温（25℃±2℃）下保存正常生长的离体保存物的方式。 3.2 低温离体保存 conservation at low temperature in vitro 通过低温条件、改变培养基成分或添加抑制型植物生长调节物质等手段以延缓保存物生长速度的离体保存方式。 3.3 超低温离体保存 cryopreservation 在液氮（-196℃）中保存离体材料，使之代谢和生长基本停止，生物学状态相对稳定的离体保存方式。 4 材料要求 4.1 基本要求 保存的材料应符合以下要求： a）用于保存的材料应该保证品种纯正，来源可靠，基本性状清楚，且未发生变异。 b) 依据D NY/T 1491 规定的方法进行病毒检测，确保材料不携带菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）等。 4.2 材料登记要求 保存的材料应进行信息登记，内容包括种质名称或编号、产地或产权单位（人）、引种情况、保存情况等（见附录A）。 5 常温离体保存 保存材料 选择符合4.1条件的材料并按照4.2要求详细登记，利用生根培养30 d左右、生长整齐一致的无菌苗为材料，切割成带2个～3个节的茎段供保存。 保存容器 采用规格为直径(18～30) mm×长(160～200) mm的试管，用内置硅胶圈的密封塑料盖或封口膜封 口，贴好标注保存编号的标签。 保存条件 MS培养基均附加0.3 mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，pH 6.0。置于温度（25±2）℃、光照强度2000 lx～3000 lx、光照时间12 h/d的条件下培养。每管加培养基15 mL～25 mL。 保存数量 每份种质5管以上，每管1个～2个茎段。 继代时间 视不同种质的生长速度，每2个～3个月继代1次。 技术指标 变异率≤2%；无菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）。 6 低温离体保存 6.1 保存材料 同5.1。 6.2 保存容器 同5.2。 6.3 保存条件 根据种质特点，下列两种方法可以选用一种: 减少培养基养分水平法：低温（5±2）℃下，1/4MS或1/2MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，该方法适宜地被、盆栽型菊花种质资源。 添加抑制型植物生长调节物质法：低温（5±2）℃下，MS+0.3 mg/ 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，培养基中添加20 mg/L～80 mg/L ABA，或者15 g/L～20 g/L甘露醇；地被、盆栽型资源宜添加低剂量ABA或甘露醇，切花型资源宜采用较高剂量。 保存数量 同5.4。 继代时间 视不同种质的生长速度，每8个～12个月继代1次。 6.6技术指标 变异率≤2%；无菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）。 7. 超低温离体保存 7.1 保存材料 选择符合4.1条件的材料并按照4.2要求详细登记，利用生根培养30 d左右、生长整齐一致的无菌苗为材料，切成0.5 cm～1 cm，含2个以上腋芽，在MS培养基附加30 g/L 蔗糖和7 g/L 琼脂，pH 6.0，温度（25±2）℃、光照强度2000 lx～2500 lx、光照时间16 h/d，培养2 w～3 w。 7.2 保存容器 采用规格为直径(15～20)mm×长(120～160) mm试管，用内置硅胶圈的密封塑料盖，贴好标注保 存编号的标签。 7.3 分离茎尖 在无菌条件下，通过解剖镜逐层剥去外层叶片,切取1 mm～2 mm大小的茎尖。 7.4 保存数量 每份种质5管以上，每管8个～10个茎尖。 7.5 预培养 茎尖分别接种到含0.4 mol/L 蔗糖浓度的MS培养基内，4℃暗培养3 d。 7.6