流式细胞术分析及应用.pptxVIP

流式细胞术分析及应用第1页/共59页 2流式细胞术分析及应用第2页/共59页 3流式细胞术的原理流式细胞术的应用流式细胞术的数据处理流式细胞术的样品制备主 要 内 容第3页/共59页 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。4一、流式细胞术的原理第4页/共59页 现代流式细胞仪包括液流系统 聚焦细胞以供检测光学系统 激发和收集光信号 电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析 5第5页/共59页 液流系统液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处6第6页/共59页 Sample Flow in Optical Cuvette7SampleLaminarFlowLow Sample Flow Rate12 mL/minSheathSheathSampleLaminarFlowSheathSheathOptical CuvetteHigh Sample Flow Rate60 mL/min第7页/共59页 样品和鞘液流8第8页/共59页 9Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid第9页/共59页 流式细胞仪的光学系统激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照。激光波长: 台式机为固定波长488nm, 635nm ，大型机波长谱线宽包括 325， 457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm光收集系统是由若干组透镜，滤波片，小孔组成，将产生的光信号引导至检测器。10第10页/共59页 流式细胞仪的光信号散射光信号荧光信号11第11页/共59页 121. 散射光信号前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信号 细胞相对大小及其表面积。 侧向角散射（SSC, Side Scatter） 入射激光90?角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。第12页/共59页 前向角散射光 ——FSC13FALS SensorLaser第13页/共59页 侧向角散射光——SSC14FALS Sensor90LS SensorLaser第14页/共59页 散射光散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据15第15页/共59页 散点图——Dot Plot16lysed whole blood第16页/共59页 2. 荧光信号荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 17第17页/共59页 Fluorochrome specification18第18页/共59页 19Compensation第19页/共59页 二、流式细胞术的应用细胞表型分析胞内蛋白的检测细胞周期分析细胞因子测定分选细胞内钙离子测量……20第20页/共59页 1.细胞表型分析21第21页/共59页 222.胞内蛋白的检测第22页/共59页 23第23页/共59页 3. 细胞周期的检测24第24页/共59页 CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂） 25第25页/共59页 4.细胞凋亡的检测26第26页/共59页 271、荧光信号的面积：对荧光光通量进行积分 2 、DNA指数(DI)：相对DNA含量= 样品G0/G1细胞DNA含量平均数 标准二倍体DNA量的平均数3、异倍体：非二倍体，包括近二倍体、四倍体、多倍体、非整倍体第27页/共59页 凋亡细胞的特点在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的FSC降低，SSC增加。细胞坏死时，细胞肿胀，FSC增大，SSC也增大28第28页/共59页 Annexin V Assay29第29页/共59页 30Annexin V/PI双染活细胞为（Annexin V-/PI-）坏死细胞为（Annexin V+/PI+）凋亡细胞（Annexin V+/PI-）第30页/共59页 Annexin V Assay----能