荧光定量PCR技术讲座.pptxVIP

荧光定量PCR技术讲座第1页/共49页 基 本 原 理第2页/共49页 基本原理Real-time qPCR的定量原理2Real-time qPCR的检测方法3Real-time qPCR的基本概念1Real-time qPCR的解析方法4Real-time qPCR的计算方法5第3页/共49页 Real-time qPCR的定义实时荧光定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。 Real-time PCR仪 ABI7500第4页/共49页 PCR：基本原理Denaturation: 94 – 96°CAnnealing: 50 – 65°CExtension: 70 – 75°C基本要素： Template Primers DNA polymerase dNTP, N=A,G,C or T第5页/共49页 与普通PCR的比较S形曲线，具有平台效应终点检测法反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能不同浓度的起始模板经PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量第6页/共49页 定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n实际的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率第7页/共49页 定量原理在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) Ct+ log M (3) log(1+Ex) Ct=- log X0 + log M Ct=-klogX0+b 第8页/共49页 每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。确定初始模板的浓度 定量原理Ct=-klogX0+b第9页/共49页 real-time qPCR使确定模板初始数量成为可能第10页/共49页 11实时荧光定量PCR中的三个概念1扩增曲线 (primary curve)2荧光阈值（threshold)3CT 值(Cycle Threshold)第11页/共49页 扩增曲线 (primary curve)荧光基团荧光检测元件扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光增长曲线图横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 第12页/共49页 荧光阈值（threshold)是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在PCR反应指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。阈值线 原则：1）要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值； 2）同时要尽量选择进入指数期的最初阶段第13页/共49页 CT 值(Cycle Threshold)Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value 第14页/共49页 Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性第15页/共49页 检测方法非特异性荧光标记： SYBR Green I特异性荧光标记：水解探针： TaqMan非水解探针：M