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苯酚法提取资料第1页/共24页第2页/共24页基本原理 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。第3页/共24页基本原理 本实验采用的0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA 制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。第4页/共24页主要试剂： （1）SDS-缓冲液：0.3％ SDS，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L 乙酸钠，用乙酸调到pH5.0。SDS乙酸钠NaCl第5页/共24页主要试剂（2）饱和酚液：重蒸苯酚用SDS溶液饱和。第6页/共24页氯仿主要试剂异戊醇液（3）氯仿-异戊醇液：24﹕1（V/V）。第7页/共24页主要试剂：（4）含2％乙酸钾的95％乙醇溶液。第8页/共24页主要试剂：（5）无水乙醇（6）溶菌酶（B.R.（1mg/L）第9页/共24页主要仪器：（1）台式高速离心机（10000r/min）第10页/共24页主要仪器：（2）Eppendorf 管（50mL）第11页/共24页主要仪器：紫外可见分光光度计第12页/共24页主要仪器分析天平第13页/共24页主要仪器真空干燥器第14页/共24页主要仪器电子天平第15页/共24页实验步骤：1．粗提取RNA 称量干燥的Eppendorf管的质量,取活性干酵母在研钵中研碎，取1g加入Eppendorf管,加10mL SDS-缓冲液使成匀浆。再加溶菌酶1mL，混匀，室温静置10min，再加10ml饱和酚液，室温下剧烈振荡5min，置冰浴中分层。第16页/共24页实验步骤：2．分离RNA 在0～4℃低温环境下，10 000r/min 离心10min。吸出上层清液，转入新的Eppendorf 管。3．提纯RNA 加同上清液等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10 000r/min 离心5min。吸出上层清液，转入另一新Eppendorf 管。第17页/共24页实验步骤： 4．沉淀RNA 加2 倍体积95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA 沉淀。再以10 000r/min 离心5min，弃上清液，第18页/共24页实验步骤：5．洗涤RNA 沉淀用少许无水乙醇洗一次，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。第19页/共24页实验步骤：6．RNA 制品纯度的测定及RNA 提取率的计算 将干燥后RNA产品配制成浓度为10—50μg／ml的溶液，在紫外可见分光光度计上测定其260nm处的吸光度，按下式计算RNA制品纯度及RNA 提取率第20页/共24页实验步骤：RNA含量=100% RNA提取率=式中，A260为260nm处的吸光度；L为比色杯光径（cm）；0.024为lml溶液含lμgRNA的吸光度第21页/共24页注意事项：1、注意安全，试验要用到的有机试剂有毒性，特别是重蒸酚。2、使用离心机时,对称的两只Eppendorf管的质量一定要相同，以保证重心在轴心上。第22页/共24页注意事项：3、有些Eppendorf管，密封不紧，一定要注意防漏。还有的Eppendorf管底部有裂纹，在离心时要把要把有裂纹的一侧放在内侧，防止Eppendorf管炸裂。4、由于我们用的是260nm不可见光,要用石英比色皿。5、石英比色皿数量有限，不要和其他比色皿弄混.第23页/共24页祝大家实验成功第24页/共24页感谢观看!