2023年生化实验讲义.docx

生化试验讲义 鹿敏、聂桓 哈工大理学院生命科学与工程系 试验一 蛋白质与氨基酸的呈色反响 蛋白质的呈色反响是指蛋白质所含的某些氨基酸及其特别构造，在肯定条件下可与某些试剂发生了生成有色的物质的反响。 不同蛋白质分子所含的氨基酸残基也是不完全一样，因此所发生的成色反响也不完全一 2样。另外呈色反响并不是蛋白质的专一反响，某些非蛋白质类物质〔含有-CS-NH、-CH 2 -NH 、2 、 -CRH-NH 、-CHOH-CH NH 等基团的物质〕也能发生类似的颜色反响。因此，不能仅仅根 2 2 2 据呈色反响的结果为阳性就来推断被测物质肯定是蛋白质。 留意：本次试验为定性试验，试剂的量取用滴管和移液器完成。 【试验目的】： 了解构成蛋白质的根本构造单位及主要连接方式。 了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反响原理。 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 【试验原理】： 〔一〕双缩脲反响 当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。 其在碱性条件下双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反响称为双缩脲反响。其反响过程如下： O O 2H N H N 2 2 C O + C O H N H N 2 2  180 0 C H NC NH CNH + NH 2 2 3 多肽及蛋白质分子构造中均含有很多肽键，其构造与双缩脲分子中的亚酰胺键一样。因此，在碱性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的呈色反响。可用于蛋白质的定 性或定量测定。其反响过程如下： 双缩脲反响不仅为含有两个以上肽键的物质全部。含有一个肽键和一个 —CS—NH ， 2 —CH —NH ，—CRH—NH ，—CH —NH —CHNH —CH OH 或—CHOHCH NH 等基团 2 2 2 2 2 2 2 2 2 NH NH 2 2 的物质以及乙二酰二胺〔O＝C——C＝O〕等物质也有此反响。NH 3 也干扰此反响，由于NH- 与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu〔NH 3 3 〕 2+。一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反 4 应，但有双缩脲反响的物质不肯定都是蛋白质或多肽。 〔二〕茚三酮反响 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反响产生黄色物质外，全部α—氨基酸及一切蛋白质都能 和茚三酮反响生成蓝紫色物质。整个反响分两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO 2 、NH 和 3 醛，水合茚三酮被复原成复原型茚三酮；其次步是所形成的复原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反响的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。该反响格外灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反响，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 此反响机理如下： 第一步： O CCCOH H C C C + R C NHOH 2 NH COOH O O CCH C C C + RC H O + NH 3 OH  + CO 2 O 其次步： OCCO O C C O C + C C C OH O O NH 2 C C N C  O + 2N H 3 OCO O C + 2H 2 O C C O O 〔三〕黄色反响 在蛋白质分子中，含有苯环构造的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反响，苯丙氨酸不易硝化，需参加少量浓硫酸才有黄色反响。 反响为： OH + H NO HO NO + H O 3 2 2 HO NO 2 OH + Na O H O N Na 肯定要参加 10％氢氧化钠溶液至碱．性．，才会进一步形成深橙色的硝醌酸钠。OH 〔四〕坂口反响 蛋白质在碱性溶液中与次氯酸盐〔或次溴酸盐〕和 α-萘酚作用产生红色的产物 。这是由于蛋白质分子中精氨酸胍基的特征反响。很多胍的衍生物如胍乙酸、胍基丁胺等也发生此反响。精氨酸是唯一呈正反响的氨基酸， 反响灵敏度达 1：250000。生成的氨可被次溴酸钠氧化生成氮。在次溴酸钠缓慢作用下，有色物质连续氧化，引起颜色消逝，因此过量的次溴酸钠对反响不利。参加浓尿素，破坏过量的次溴酸钠，能增加颜色的稳定性。 N H2C N H 2 C O N H 2 C N H N H ++C H H O C H + + 2 2 N H C H C H 3 2 2 C H C H 2 2 C H N H 2  C H N H 2 C O O H C O O H 此反响可以用来定性鉴定含有精氨酸的蛋白质和定量测定精氨酸的含量。 (五)乙醛酸反响 在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反响生成紫色物质 ,反响机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝