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* * 实验七酶联免疫吸附试验 第一页，共十一页，2022年，8月28日 一、实验目的 掌握酶联免疫吸附实验的操作过程和原理。 第二页，共十一页，2022年，8月28日 二、实验原理 　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相 载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其 免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗 原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成 的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体， 也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量 呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的 量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分 析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达 到很高的敏感度。 第三页，共十一页，2022年，8月28日 第四页，共十一页，2022年，8月28日 三、实验材料 聚乙烯塑料酶标板（PH9.6时可吸附蛋白Ag） 抗原：伤寒杆菌O901煮沸或超声波粉碎抗原 待测血清 冻干酶联葡萄球菌A蛋白（HRD—proteinA）纯品 邻苯二胺（OPD） 包被液：0.05M碳酸钠—碳酸氢钠溶液PH9.6 稀释液：10%免疫血清PBS—吐温20，防止非特异性吸附 洗涤液：0.02MTrisTWeen20 ,Ph7.4防止非特异性吸附 底物溶液：0.02M磷酸氢二钠25.7毫升， 0.1M柠檬酸24.3毫升，蒸馏水50毫升。临用前新鲜配制，在上述缓冲液中溶解40毫克邻苯二胺，然后加入30%双氧水0.15毫升，底物对光敏感，需要避光并立即使用。 终止液；2M硫酸 第五页，共十一页，2022年，8月28日 四、实验步骤 1．抗原包被 　　取洁净的聚苯乙烯微量反应板，于每孔内加伤寒抗原 0.1毫升（用包被缓冲液稀释，蛋白含量10微克/毫升）， 置37℃1小时，弃抗原液，用洗涤液3次每次3分钟。 第六页，共十一页，2022年，8月28日 2．加待测血清 　　于每孔内分别加不同稀释度（如1：5，1：10，1： 20…1：80）的待测血清，PBS空白对照，阴性对照血 清，阳性对照血清各0.1毫升。置37℃30分钟，洗涤3次。 第七页，共十一页，2022年，8月28日 3．加酶联A蛋白 　　于每孔加酶联A蛋白各0.1毫升，置37℃20分钟，洗涤 3次。 第八页，共十一页，2022年，8月28日 * *