实验二质粒DNA的酶切鉴定.pptxVIP

第1页/共43页实验二质粒DNA的酶切鉴定第2页/共43页1. 实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。 第3页/共43页2. 相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。第4页/共43页1) 寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。第5页/共43页2)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型第6页/共43页第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 第7页/共43页第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：第8页/共43页粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G ‘ AATTC ……3’ 3’…… C TTAA ‘G …… 5’从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。第9页/共43页平头末端：II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：5’…… GAT ‘ ATC …… 3’3’…… CTA ‘ TAG …… 5’ 　切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、 3’…… CTA和TAG …… 5’。这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。第10页/共43页第三类（ III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。第11页/共43页3) 限制性核酸内切酶的命名法用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用d，即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。第12页/共43页4) 影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA的纯度；(2) DNA的甲基化程度；(3) 酶切消化反应的温度；(4) DNA的分子结构；(5) 溶液中离子浓度及种类；(6) 缓冲液的 pH值。第13页/共43页实验材料和试剂实验材料：质粒DNA：上周实验课提取纯化。 实验试剂：酶及其酶切缓冲液：购买成品。 酶及其酶切缓冲液：购买成品。琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 第14页/共43页第15页/共43页实验仪器恒温水浴锅第16页/共43页实验步骤(1)EP管编号,加样反应 10×K Buffer 2μL质粒DNA 16μLXho I 1μLBamH