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控制菌检查法的验证 目的：增加试验方法的完整性保证检验结果的可靠性。 何时验证：建立供试品的微生物限度检查法时；供试 品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时 。 试验菌株：按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。 阴性菌对照菌株 第二十九页，共七十二页，2022年，8月28日 控制菌检查法的验证 菌液制备:50～100cfu/ml。 验证方法：试验组、阴性菌对照组。 结果判断：试验组应检出、阴性菌对照组不得检出。 第三十页，共七十二页，2022年，8月28日 微生物限度检查法 第三十一页，共七十二页，2022年，8月28日 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。   第三十二页，共七十二页，2022年，8月28日 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为50cm2；化学膜剂为50cm2贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml。  第三十三页，共七十二页，2022年，8月28日 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 第三十四页，共七十二页，2022年，8月28日 除另有规定外，常用的供试品制备方法 1.液体供试品 2.固体供试品 3. 特殊供试液制备方法 （1）非水溶性供试品 ① 司盘80 ② 十四烷酸异丙酯 第三十五页，共七十二页，2022年，8月28日 （2）非水溶性膜剂供试品 ①肠溶及结肠溶供试品 ②气雾剂、喷雾剂供试品 第三十六页，共七十二页，2022年，8月28日 （3）具抑菌活性的供试品 当供试品有抑菌活性时，应消除其抑菌活性后，再依法检查。 常用的方法有：①加大培养基量稀释法 ②离心沉淀集菌法 ③薄膜过滤法 ④中和法 第三十七页，共七十二页，2022年，8月28日 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证 1、计数方法的验证 当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认该计数方法的可靠性。若供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，应进行计数方法可靠性的再验证。 验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。 第三十八页，共七十二页，2022年，8月28日 菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），以保证试验菌株的生物学特性。应采用适宜的保存技术，防止试验菌株发生变异。 第三十九页，共七十二页，2022年，8月28日 方法验证 CP BP USP JP 菌株 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠球菌 黑曲霉 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 白色念珠球菌 枯草芽孢杆菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠球菌 黑曲霉 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 沙门菌 加入菌量 （cfu) 50~100 100 105-106 103 检验方法 中和法 平皿法 稀释法 离心沉淀法 薄膜过滤法 中和法 平皿法 稀释法 薄膜过滤法 中和法 平皿法 稀释法 薄膜过滤法 平皿法 稀释法 平板表面涂抹法 薄膜过滤法 第四十页，共七十二页，2022年，8月28日 菌液制备 用无菌0.9%氯化钠溶液制成每1ml含50~100cfu的菌悬液和50~100cfu的孢子悬液。 菌种 培养基 培养温度（℃） 培养时间（h） 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠球菌 黑曲霉 营养肉汤培养基 改良马丁培养基 35~37 23~28 18~24 24~48 5~7（天） 第四十一页，共七十二页，2022年，8月28日 黑曲霉菌液的制备 新鲜培养的黑曲霉斜面中加入3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～00cfu的孢子悬液。 第四十二页，共七十二页，2022年，8月28日 验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率