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生物竞赛辅导资料重组DNA技术;重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。;重组DNA操作一般步骤：;获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。; 细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建; 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。; 基因文库的构建 将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。; 反转录人工合成互补DNA; 聚合酶链式反应（PCR）; 聚合酶链式反应（PCR）; 聚合酶链式反应（PCR）; PCR技术的发明;基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。 微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。; 限制性内切酶; 载体;1．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。 2．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。 3．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点; pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出?半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被?半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆; 以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆; 一般克隆基因的检查和鉴定方法;32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法;基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备??需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。 通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物;构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株;遗传转化常用的方法;纪念发明者Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析;Southern杂交分析示例;重组DNA技术的一般操作步骤有：(1)获得目的基因；(2)构建重组质粒；(3)转化受体细胞；(4)筛选和鉴定转化子；(5)培养转化细胞获得所需性状或所需产物。 获得目的基因的方法有：提取总DNA构建基因文库并从中调用；以mRNA为模板合成互补DNA片段；利用PCR特异性扩增所需目的基因片段等。用紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。 用限制性内切酶识别并切开核酸序列特定位点，将外源基因插入到载体中，用重组载体转化宿主细胞，外源基因将随宿主的繁殖而复制，这种过程称为基因的克隆。 凝胶电泳是用于分离、纯化和鉴定DNA片段最常规的实验技术。可依据DNA分子的大小来使其分离。还可以利用DNA杂交技术直接鉴定带有重组质粒的细菌克隆。 利用载体法或基因直接转移等技术将外源目的基因转入合适的宿主细胞中进行表达，获得所需表达产物或所需性状。用Southern杂交对转基因生物外源目的基因进行检测分析。;感谢观看！