实验一牛乳中酪蛋白的制备与鉴定.pptxVIP

第1页/共13页实验一牛乳中酪蛋白的制备与鉴定第2页/共13页实验一 牛乳中酪蛋白的制备与鉴定【温馨提示】请将教室水浴锅打开，温度调至40℃。并将乙酸-乙酸钠缓冲液（1-2瓶/室）放入水浴锅内，预热至40℃。实验结束后务必断开电源。实验结束后，务必将使用过的玻璃器皿洗净、晾干、放回原处。第3页/共13页一、实验目的（1）学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。（2）了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。（3）验证蛋白质的双缩脲反应性质。（4）学习和掌握蛋白质双缩脲反应的原理和方法。第4页/共13页二、实验原理1.牛乳中酪蛋白制备 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7-4.8。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7-4.8时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，乙醚除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。第5页/共13页二、实验原理2.酪蛋白的双缩脲反应 两分子尿素加热到180℃左右时，生成双缩脲并放出一分子氮，双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。 第6页/共13页C 端N 端二、实验原理 蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲结构相似，因此，蛋白质在碱性环境中也能与Cu2+结合也发生双缩脲反应，生成紫红色化合物。由于，紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。颜色深浅可在540 nm比色测定，故可用此法来测定蛋白质含量。第7页/共13页三、仪器和试剂1、仪器：恒温水浴锅、低速离心机、托盘天平、电子天平、酒精灯等。1支25mL试管、搅拌棒、15mL离心管、滤纸。7支15mL试管。移液管、吸耳球、移液枪（200uL）、枪头（200uL）。2、材料与试剂：牛奶乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.6）、1%氢氧化钠、10%乙酸、蒸馏水、无水乙醇。蒸馏水、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸、饱和氢氧化钙、双缩脲试剂。尿素、双缩脲试剂。（教师演示用）第8页/共13页四、实验步骤1、酪蛋白的制备： （1）量取10mL牛奶置于25mL刻度试管中，水浴中加热至40℃（约5min）。 （2）在搅拌下慢慢加入10mL预热至40℃的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.6）。用精密试纸调pH值至4.7-4.8（可选择1%氢氧化钠或10%乙酸溶液进行调整，注意：缓慢滴加）。40℃保温10min，使沉淀完全。 （3）将上述悬浮液冷却至室温。2000r/min离心5min，弃去上清液。第9页/共13页四、实验步骤1、酪蛋白的制备： （3）往沉淀物中加入5mL蒸馏水，混匀后2000r/min离心5min， 弃去上清液。 （4）将洗净的沉淀物加入3mL无水乙醇，混匀后2000r/min离心5min， 弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。 （5）将沉淀物全部摊开在已称过重的滤纸上，置于25℃烘箱中烘干。 （6）准确称重，计算牛乳中酪蛋白含量（g/10mL）,并与理论含量为3.5g/100mL牛乳相比较，求出实际得率。第10页/共13页四、实验步骤2、酪蛋白溶解度的鉴定： 取6支15mL试管，分别加入蒸馏水、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化钙各1mL。于每管中加入少量相同质量的酪蛋白粉末（ 25℃烘箱中烘干的酪蛋白粉末），不断摇荡，观察并记录各管中酪蛋白的溶解度。第11页/共13页四、实验步骤3、酪蛋白的颜色反应（双缩脲反应）：此步骤由教师演示：取少量尿素结晶，放入干燥的试管，微火加热使尿素熔化，熔化的尿素开始硬化时停止加热，尿素放出氮，形成双缩脲。冷却后，加入1mL双缩脲溶液，振荡，观察实验现象。 [制备双缩脲+双缩脲溶液（1%CuSO4+酒石酸加纳+1%KOH）=紫红色]向1支15mL试管中加入少量酪蛋白溶液，加入1mL 双缩脲溶液，随加随摇，观察实验现象。 [制备酪蛋白+双缩脲溶液（1%CuSO4+酒石酸加纳+1%KOH）=？]第12页/共13页五、实验结果、计算与分析 结果一：酪蛋白的制备：1、酪蛋白含量（g/mL）=酪蛋白g/10mL2、酪蛋白得率=测定含量/理论含量×100%牛乳酪蛋白理论含量为3.5g/100mL结果二：酪蛋白的溶解度鉴定：1.酪蛋白溶于哪些溶液？ 蒸馏水、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化钙（表格形式，状态：不溶解，部分溶解，全部溶解）结果三：酪蛋白的双缩脲反应：4、酪蛋白的双缩脲反应分析。（颜色描述并分析）（为何酪蛋白与双缩脲试剂反应呈现紫红色？）第13页/共13页感谢您的欣赏