LncRNACASC2表达在肝癌中的临床意义及对细胞增殖的调控.docxVIP

? ? LncRNACASC2表达在肝癌中的临床意义及对细胞增殖的调控 ? ? 李江涛 许 俊 (1.枝江市人民医院 普通外科，湖北 枝江 443200； 2. 三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 胃肠外科， 湖北 宜昌 443003) 肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，据统计，我国每年肝癌的新发和死亡病例均占全球一半以上[1]。近年来，虽然肝癌的早期诊断技术得到了提高，但由于其发病隐匿，早期无显著症状，大部分确诊患者已进展到中晚期，难以进行有效的手术治疗，从而导致肝癌患者的5年生存率较低[2]。因此，深入研究肝癌发生和进展的分子机制，对于寻找新的诊治标志物，提高肝癌患者的预后具有重要意义。长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一类长度大于200 nt的内源性非编码RNA，可通过影响转录激活、表观修饰等机制对多种生物学过程发挥重要的调控作用[3]。目前已发现多种lncRNA与肿瘤的发生密切相关。肿瘤易感性候选基因2(cancer susceptibility candidate 2, CASC2)是近年来发现的一种lncRNA，其在非霍奇金淋巴瘤[4]、胃癌[5]、结直肠癌[6]中表达下调，发挥抑制肿瘤进展的作用，但在肝癌中少有报道。本研究旨在探讨CASC2在肝癌中的调控作用，并分析其表达的临床意义。 1 材料和方法 1.1 一般资料 本研究的组织样本均来源于我院普外科收治的42例肝癌患者，其中癌旁正常组织距离肿瘤边缘≥2 cm。所有患者均经病理确诊且随访资料完整，患者术前未经过抗肿瘤治疗。所有患者每1～3个月随访1次，随访过程记录患者肿瘤复发、转移、生存情况，持续2年；2年后每6个月随访1次，2020年12月1日结束随访或患者死亡。所有患者均签署知情同意书，研究经医院伦理委员会批准。 1.2 细胞系 人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、Huh7、HCCLM3和正常肝细胞系HL7702均购自中国科学院。细胞采用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培养基(含100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素)在37℃、5%CO2培养箱中培养。 1.3 RT-PCR检测 采用Trizol试剂按照使用说明提取肝癌组织和细胞中总RNA，进行逆转录反应获得cDNA。采用SYBR Green法进行RT-PCR检测，以U6作为内参，结果采用2-△△Ct法进行分析。设置反应条件为：95℃，5 min；再40个循环的95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s。其中CASC2上游引物序列：5‘-AGCGGTACCCCTGGCCGCGTCCT-3’，下游引物序列：5‘-TTGAGGGTCACGGCAGCACATTC-3’；miR-221上游引物序列：5‘-GGATCGGTGCATGTACTGC-3’，下游引物序列：5‘-CAGTGGCTGCATAAGAGT-3’；U6上游引物序列：5‘-ACACTCGTTGCTAGCGGTAT-3’；下游引物序列：5‘-ACACTGGGTCAGGTACCTGTC-3’。 1.4 细胞转染 采用LipofectamineTM 2000试剂进行细胞转染，首先将Huh7细胞接种到6孔板中，接种密度为每孔1.5×105个细胞，待细胞生长24 h后(汇合度80%)，分别将pcDNA3.0-CASC2及其对照pcDNA3.0-NC与LipofectamineTM 2000试剂混匀，转染Huh7细胞，放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养。 1.5 CCK-8检测 将对数期的Huh7细胞接种到96孔板中，接种密度为每孔7.5×103个细胞，每组细胞设置3个平行孔。各组细胞分别于转染后的24 h、48 h、72 h和96 h加入CCK-8试剂，放入37℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，采用酶标仪检测450 nm处OD值，并绘制生长曲线。 1.6 Transwell迁移和侵袭实验 Transwell小室的上室和下室分别加入无血清培养基和完全培养基，将200 μL的细胞悬液(密度为1×105个/mL)接种至Transwell小室的上室中，放入37℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。去除表面残留细胞后，用0.5%(w/v)结晶紫溶液进行染色，随机选取5个复孔计数，取平均数。侵袭实验预先准备40 mL的Matrigel胶置于4℃冰箱中过夜，再与无血清培养基混合均匀，加入上室中，余步骤与迁移实验相同。 1.7 双荧光素酶实验 通过TargetScan和Starbase数据库发现，CASC2与miR-221存在互补结合位点。分别将CASC2-WT和CASC2-MUT序列片段构建至psiCHECK2载体，采用Lipofectamine