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社区感染产金属酶铜绿假单胞菌主要基因型调查 铜绿假单胞菌是一种条件菌株，是引起社区感染的主要病原体之一。其对多种抗菌药物表现为天然耐药和获得性耐药, 加之近年来抗生素、免疫抑制剂、肿瘤化疗等药物的广泛应用, 多重耐药和泛耐药铜绿假单胞菌的数量不断上升, 已成为临床抗感染治疗的一大难题, 目前对社区感染耐亚胺培南铜绿假单胞菌的有关研究甚少。本文为收集到具有代表性菌株, 故选择相隔较远的三家医院作研究对象, 对38株社区感染耐亚胺培南铜绿假单胞菌进行金属酶情况和主要的基因型检测, 结果报告如下。 1 1.1 来源：蘑菇 1.1.1 菌株感染或种植史 参照2005年美国疾病预防与控制中心 (CDC) 鉴别标准:门急诊或入院后48 h内的分离菌株;无亚胺培南耐药铜绿假单胞菌 (imipenem resistant pseudomon asaeruginosa, IRPA) 感染或种植史, 1年内无住院或与护理机构、收容所、托儿所等机构接触史;无透析、手术或留置导尿及其他穿刺医疗操作装置 1.1.2 本实验菌株的基因文明 2010年1月至2012年6月广州医学院荔湾医院、广州市番禺区沙湾人民医院和增城市朱村街社区卫生服务中心三家医院临床微生物室技术人员负责收集临床资料及标本, 将符合社区感染诊断标准的铜绿假单胞菌, 保存于-40℃冰箱中备用。质控菌株:大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853购于广东省临检中心;产MBL (IMP-1型和VIM-2型) 铜绿假单胞菌的阳性对照菌株由上海交通大学医学院附属瑞金医院惠赠。 1.2 药物、试剂与仪器 40SI全自动细菌鉴定药敏检测系统 (美国Dade Behring) , BCD-200HC型普通冰箱 (中国华凌) , ZKV-L200-4超低温冰箱 (日本Sanyo) , 生物安全柜 (江苏安泰) , 抗菌药物纸片、M-H琼脂 (英国Oxoid) , PCR 仪器 (Biometra, 德国) , 凝胶成像系统 (上海天能公司) , 各种靶基因引物合成及PCR扩增产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。 1.3 实验方法 1.3.1 细菌鉴定及药敏试验结果 使用MicroScan Walk Away 40SI全自动细菌鉴定药敏检测系统及纸片扩散法 (K-B法) 测定, 按美国临床实验室标准化研究所 (CLSI) 的抗菌药物敏感性试验执行标准判断结果。 1.3.2 表中的模型检测 采用改良三维试验法检测IRPA的MBL表型 1.3.3 pcr扩增 采用煮沸法提取细菌DNA后, 用PCR对IMP-1和VIM-2金属酶基因进行扩增, IMP-1引物序列:上游5′-CTACCGCAGCAGAGTCTTTG-3′, 下游5′-AACCAGTTTTGCCTTACCAT3′;VIM-2引物序列:上游5′-ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG-3′, 下游5′-CTACTCAACGACTGAGCG-3′。PCR反应体系:总体积为25 μL, 正、反向引物 (10 μmol/L) 各1 μL, 2×PCR TaqMix 12.5 μL, DNA模板1 μL, 去离子水9.5 μL;PCR反应条件:预变性94℃ 3 min, 变性94℃ 30 s, 退火55℃ 30 s, 延伸72℃ 60 s, 共30个循环, 最后延伸72℃ 5 min, DNA Marker为DL2000;PCR产物长度IMP-1为587 bp, VIM-2为801 bp, 用1.5%琼脂糖凝胶对产物电泳, 电压90 V/cm, 电泳40 min后用溴化乙锭染色20 min, 清水冲洗, 拍照记录结果。PCR 扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序, 结果在GenBank 网上查询。 1.4 统计方法 运用SPSS 13.0统计软件, 率的比较采用χ 2 2.1 医院和社区对irpa的感染情况比较 社区感染铜绿假单胞菌检出395例, 亚胺培南耐药38例 (9.6%) , 医院感染铜绿假单胞菌检出482例, 亚胺培南耐药106例 (22.0%) , 社区感染IRPA明显低于医院感染 ( 2.2 产金酶表型筛选实验 改良三维试验检测社区感染亚胺培南耐药铜绿假单胞菌产金属酶情况, 38株IRPA 检出7株MBL阳性, 检出率为18.4%。 2.3 需要3株凝胶电泳检测金属酶 对7株产金属酶表型阳性铜绿假单胞菌用IMP-1和VIM-2引物进行PCR扩增检测, 凝胶电泳显示3株为VIM-2型金属酶 (图1~2) 。扩增PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序, 测序结果登陆Gen Bank () 比对。 3 加强药药使用管理 铜绿假单胞菌在自然界分布广泛, 常存在于正常人皮肤、呼吸道和消化道等处, 在机体防御系统出现损伤