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双向电泳实验过程及相关溶液配置 实验过程 一、 实验原理：2-DE 的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向 SDS是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。 二、 实验步骤： 样品的溶解 取纯化后的晶体蛋白 3.0mg，加入 300ul 裂解液(1mg 蛋白:100ul 裂解液)振荡器上振荡 10min 左右，共处理一个小时。其中每隔 10～15 分钟振荡一次，然后 13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清分装，每管 70ul，—80oC 保存。 Bradford 法测蛋白含量 取 0.001g BSA（牛血清白蛋白）用 1ml 超纯水溶解,测定 BSA 标准曲线及样品蛋白含量。取 7 个 10ml 的离心管，首先在 5 个离心管中按次序加入 0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的 BSA 溶解液，另 2 管中分别加入 2 ul 的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为 80ul），然后，各管中分别加入4ml 的 Bradford 液（原来配好的Bradford 液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min 在 595nm 下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度 BSA 的 OD 值，再测样品 OD 值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如： 编号 蛋白量（ul） Buffer(ul) Bradford(ml) OD595 值 1 0 80 4 0 2 5 75 4 0.024 3 10 70 4 0.061 4 15 65 4 0.091 5 20 60 4 0.116 Bt42 Bt4 2 78 4 Bt4 4 76 4 转 Bt4 2 78 4 转 Bt4 4 76 4 0.075 标准曲线方程式：Y= aX+b.其中 Y 为 OD 值，X 为蛋白含量。 a、b 通过作图输入数据可知 相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得 OD 值测量过程： 比色皿用 70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD 值。 双向电泳第一向IEF（双向电泳中一律使用超纯水） 水化液的制备 称取 2.0mg 的 DTT，用 700ul 水化液储液溶解后,加入 8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v） IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。 在含 300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul， 振荡器上振荡混合,13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。 点样，上胶 分两次吸取样品，每次 170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加 入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30 分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。 IPG 聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20oC） S1 (30v, 12hr, 360vhs, step) S2 (500v, 1hr, 500vhs, step) S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step) S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad) S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共计 44110vhs, 19.5 小时 其中 S1 用于泡胀水化胶条，S2 和 S3 用于去小离子，S4 和 S5 用于聚焦 平衡 用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸， 如果为 18cm 的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液 A，平衡液B 先后平衡 15min。 注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。 平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的 Marker，转入 SDS—PAGE 胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮 5%的琼脂糖 10ml。 双向电泳第二向SDS 配胶(两根胶条所用剂量) 分离胶：（T=8% 80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加 APS 和