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超高效液相色谱-质谱联用法测定羚羊角肽 山羊感冒片通常用于临床治疗。它由10种药物组成：宁夏天竺葵、生姜、当归、悬浮连翘、生姜、桔梗、薄荷素油和甘草。具有清热解表之功效，可用于风热汗虚证的治疗。方中羚羊角尤擅清心热，对风火扰心引起的睡眠不安、烦躁等感冒相关症状有非常好的治疗效果 目前针对羚羊感冒片的质量控制研究主要有连翘、桔梗等薄层色谱法鉴别 1 仪器、试剂和仪器 Quattro Premier XE超高效液相色谱-质谱联用仪(Waters公司);十万分之一电子天平(CP225D型，Sartorius公司);百万分之一电子天平(MSE3.6P-0CE-DM型，Sartorius公司);超声波清洗器(KQ-500E型，昆山市超声仪器有限公司)。 胰蛋白酶(Sigma公司，批号:SLBG6452V);羚羊角肽(上海强耀生物有限公司，批号:04010028811，含量为98.11%);无水乙醇、盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇、碘代乙酰胺、碳酸氢铵等试剂均为分析纯;羚羊感冒片为市售样品，批号信息见表1。 2 方法和结果 2.1 液体和质量分析的条件 液相条件:色谱柱:ACQUITY UPLC 质谱条件:三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI 2.2 溶液的制备 2.2.1 盐酸不同氨基甲烷的合成氧化应环 取本品10片，糖衣片除去包衣，称定重量，研细，取约1.0 g，精密称定，加水25 ml，超声处理(100 W,40 kHz) 30 min，离心(离心力805×g) 10 min，沉淀加无水乙醇5 ml，涡旋使其充分混匀，离心(离心力805×g) 10 min，将沉淀置水浴上蒸干，精密加入10 ml pH为8.0的缓冲液(称取573.1 g盐酸胍，121.1 g三羟甲基氨基甲烷，0.734 g乙二胺四乙酸二钠，加水溶解，调节pH，并稀释至1L，摇匀，即得)和0.5 mol·L 2.2.2 缓冲液的配制 精密称取羚羊角肽对照品12.01 mg，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液2 ml，置于100 ml量瓶，加入1 ml上述p H 8.0的缓冲液，再精密加入0.5mol·L 2.2.3 阴性样品溶液 精密称取不含羚羊角的羚羊感冒片阴性样品适量，同“2.2.1”项下方法制得阴性样品溶液。 2.3 进样检测分析 取供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液各5μl，在上述色谱及质谱条件下进样检测，结果见图1。阴性样品溶液在与羚羊角肽对照品溶液相应的出峰位置没有干扰峰出现，供试品溶液在与羚羊角肽对照品出峰位置有相对应的色谱峰出现，表明该方法专属性良好。 2.4 常数限制 精密量取羚羊角肽对照品溶液1 ml，置10 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到浓度为11.78 ng·ml 2.5 线性对照溶液 精密量取“2.2.2”项下羚羊角肽对照品储备溶液1,2,5,10,20 ml，分别置100 ml量瓶中，用水稀释成不同浓度的线性对照溶液。精密量取线性对照溶液及对照品储备液各5μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以m/z 697.66→1 021.48定量离子对对应的峰面积值(Y)为纵坐标，羚羊角肽对照品浓度(X，μg·ml 2.6 测定条件及峰面积 取羚羊角肽对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续测定5次，记录峰面积。结果得羚羊角肽峰面积的RSD为1.2%(n=5)，表明仪器精密度良好。 2.7 测样溶液制备 取本品(编号:SFX-29) 30片，除去包衣，称定重量，研细，取约1.0 g，精密称定，共6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并计算含量。结果羚羊角肽的平均含量为6.21μg·g 2.8 进样和进样时间 取同一供试品溶液，分别在0,2,4,6,12,24 h按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。结果羚羊角肽峰面积的RSD值为2.6%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。 2.9 羚羊角粉包的制备 取已知羚羊角肽含量的样品20片(编号:SFX-29)，除去包衣，称定重量，研细，取6份，每份0.5 g，精密称定，分别加入约1.5 mg的羚羊角粉(北京某饮片公司提供，批号:160819008;经测定羚羊角肽含量为1.95μg·mg 2.10 样品含量的测量 本次收集的市售样品均为糖衣片(规格:片心重0.3 g)，共5个厂家9批样品，按上述方法测定，结果见表1。 3 样品前处理条件的优化 参考相关文献 羚羊感冒片中羚羊角、桔梗、部分金银花和薄荷素油为直接入药，其他药味水煎煮后取提取物入药。因羚羊角中角蛋白含大量二硫键，不溶于水和乙醇，故可采用水和无水乙醇首先对羚羊感冒片进行除杂，以减少供试品溶液中过多杂质给含量测定带