基础学习实验目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定演示文稿.pptVIP

重新回到双引物的界面 当前第31页\共有63页\编于星期三\2点 “Edit”－“Copy”－“Sense Primer” 5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3 输出引物序列 当前第32页\共有63页\编于星期三\2点 了解并掌握PCR基因扩增的基本原理 熟悉PCR基因扩增技术的具体操作过程 实验目的 第三部分，PCR实验操作 当前第33页\共有63页\编于星期三\2点 一、概述 PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNA合成 酶和四种脱氧核糖核酸进行DNA的体外合成反应。 PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。 该技术在上个世纪80年代中期由美国K.Mullis发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，K.Mullis也因此获得1993年度的诺贝尔化学奖。 当前第34页\共有63页\编于星期三\2点 二、PCR基本原理 DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是 DNA聚合酶、DNA连接酶、引发酶、RNA引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。 PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个PCR中必需成分是 1. 模板DNA 2. DNA聚合酶 3. 四种脱氧核糖核酸 4. 正向和反向两条引物 5. 适当的缓冲体系。 当前第35页\共有63页\编于星期三\2点 模板序列：待扩增的DNA序列，一般为双链的DNA可包括线形双螺旋DNA，如基因组DNA，及闭环双链DNA，如质粒； 模板的来源很广，如从细胞/细菌中提取基因组DNA、提取mRNA经反转录得到cDNA、质粒、病毒等； 每个反应中模板的量为1 ng～1 μg。质粒DNA和纯化的DNA的量可少一些，而基因组DNA的量应多一些。 PCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致PCR的非特异性扩增。 1、模板DNA 当前第36页\共有63页\编于星期三\2点 引物（primer）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为5′端引物和3’端引物，或称为正向引物和反向引物。 通常DNA及mRNA序列的写法为5′→3′，所以5′端引物与目的序列的5′末端序列相同，而3′端引物与目的序列的3′末端序列反向互补。 2、引物 它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。 为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有15～18 bp。 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 上游引物 下游引物 当前第37页\共有63页\编于星期三\2点 DNA聚合酶：以DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的DNA的一种酶。 早期的PCR反应使用的DNA聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但该酶在高温下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。 随着新的耐热DNA聚合酶的发现及在PCR反应中的应用，使PCR操作更方便，产量更稳定。 目前商品化的DNA聚合酶有Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶最适工作温度为75-80℃。该酶具有5′→3′聚合酶活性，在镁离子存在情况下可催化核苷酸沿5′→3′方向发生聚合反应。 3、DNA聚合酶 当前第38页\共有63页\编于星期三\2点 4、脱氧核糖核酸 四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和dGTP，为PCR反应中DNA合成原料。 在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。 当前第39页\共有63页\编于星期三\2点 缓冲液提供PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有KCl、Tris-Cl和MgCl2。 其中Mg2＋的浓度最重要，它能影响DNA聚合酶的活性，以及模板与PCR产物的解链温度。 5、缓冲液 当前第40页\共有63页\编于星期三\2点 变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的DNA分子；在应用Taq DNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在94℃～95℃条件下进行。这也是Taq DNA聚合酶进行30个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。 退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低5～10℃，PCR实验要对退火温度进行优化。 二、PCR基本步骤 当前第41页\共有63页\编于星期三\2点 延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种