原代细胞制备操作SOP.docVIP

原代细胞制备操作SOP 编号： SOP-ZL015-00 页 码： 1\3 版本号：01 修订号：00 机密等级： 秘密 起草人 起草日期 颁发部门 质量管理部 审核人 审核日期 批准人 批准日期 生效日期 分发清单 研发部[ ]质量管理部[ ] 综合管理部[ ]生产管理部[ ] 市场销售部[ ]财务部[ ] 1. 目的 建立原代细胞制备操作规程，以保证试验的顺利进行和制备的细胞生长良 好，满足检验和试验需要。 2. 范围 适用于实验室原代细胞的制备，如：牛肾原代细胞、牛睾丸细胞制备等。 3. 职责 3.1. 质量管理部：负责本规程的起草。 3.2. 质量管理部QC人员：负责本规程的实施。 3.3. 总经理：负责本规程的审批。 4. 定义 无 5. 引用标准 无。 6. 材料 6.1. 材料准备： 6.1.1． 细胞培养液：见《细胞培养液的制备SOP》。 6.1.2． EDTA－胰酶 ： 见《胰酶的制备程序》 6.2． 实验器具 6.2.1． 手术器械：眼科剪、眼科镊、手术剪、手术刀、镊子、止血钳等。 6.2.2． 玻璃器皿：大平皿、三角烧瓶250ml（含盖）、三角烧瓶（含盖）500ml、 烧杯（含盖）100ml、烧杯500ml（含盖）、烧杯 1000ml（含盖）、注射 器、离心管（含盖）、玻璃漏斗、吸管、玻璃珠等。 6.2.3． 对以上器材按其性质高压蒸汽消毒或干烤消毒 6.2.4. 消毒纱布 6.3． 仪器 6.3.1． 36℃培养箱培养用 6.3.2 普通冰箱 贮藏试剂用 7. 流程图 无 8. 内容 8.1. 取材：无菌采取代细胞的动物组织，置于消毒器皿中。 8.2. 漂洗：用灭菌培养液反复清洗组织，后移入洁净区内。将组织在500单位 双抗菌素溶液中浸泡三次，浸泡时间分别为20min和30min。 8.3. 剪切：剪去组织被膜，然后剪下组织的所需部分，放入PBS液反复漂洗除 净血渍。将洗净的组织块移入小烧杯中，用剪刀剪成0.5-1.0mm2小块。 8.4. 消化：收集剪切后的组织小块，移到装有小玻璃珠的三角烧瓶中，用PBS 液洗1-2次，加入沉淀量5-8倍量的0.25%胰蛋白酶37℃作用30-60min。 8.5. 制备细胞悬液 8.5.1． 方法一：弃去胰蛋白酶消化液，加入培养液轻摇三角烧瓶后弃去培养液， 以降低消化液的浓度，加入培养液后剧烈摇动三角烧瓶使小玻璃珠冲击组 织小块分离细胞制取细胞悬液，吸取上清细胞悬液，再加入培养液，再继 续摇三角烧瓶收集上清细胞悬液，反复数次，把所收集的细胞悬液混合到 一起，分到细胞培养瓶中。 8.5.2． 方法二：在方法一的基础上把细胞悬液用6-8层纱布过滤后分装到细胞培 养瓶中。 8.5.3． 方法三：在方法一的基础上把细胞悬液用6-8层纱布过滤到细胞离心管中 离心（800r/min，5-8min），然后弃去上清液，加入培养液轻轻吹打细胞 分散后计数，以约5.0×105/ml左右的细胞浓度接种到细胞培养瓶中。 8.6． 培养:在细胞培养瓶上标记细胞名称、制备日期等相应标记后放37℃恒温 培养箱或37℃、5%CO2温箱中培养。待用或保存。 9. 注意事项 9.1． 准备制备细胞的组织一定要新鲜，现做现取，不要隔夜。 9.2. 每个操作步骤要注意无菌。 9.3 所用器具要用蒸馏水洗净灭菌。 10. 附录及派生记录 10.1． BTC原代细胞制备记录F-SOP-ZL015-01 11. 相关文件 无 12. 修订记录 修订号 修改内容 生效日期