促细胞增殖检查SOP.docVIP

资料整理 资料整理 促细胞增殖检查SOP 编号：SOP-ZL009-00 页 码： 1 / 5 版本：01 修订号：00 机密等级： 秘密 起草人 起草日期 颁发部门 质量保证部 审核人 审核日期 批准人 批准日期 生效日期 分发清单 研发部[ ]质量管理部[ ] 综合管理部[ ]生产管理部[ ] 市场销售部[ ]财务部[ ] 目的 规定新生牛血清支持细胞增殖检测试验操作程序。 指导操作者按本程序进行新生牛血清支持细胞增殖检测试验的操作。 适用范围 本程序包括细胞培养、细胞生长曲线的测定、细胞倍增时间的测定及克隆率的测定等操作。 职责 3.1 质控部负责本规程的起草 3.2 总经理负责本规程的审批 3.3 质控部检验人员负责本程序的操作 定义 4.1 SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞 4.2 T/A 倍增时间 引用标准 《中华人民共和国药典》2015版四部 材料及设备 6.1. 供试品及参考品/标准品 供试血清，记录批号 6.2 化学药品及试剂 细胞生长液，参见《细胞生长液配制程序》。 6.3 仪器/设备 6.3.1 超净台。参见《超净工作台使用与维护程序》。 6.3.2 校验效期内的37℃CO2孵箱1台（记录型号，编号）。使用参见《CO2孵箱使用及维护程序》。 6.3.3 校验效期内的倒置显微镜1台（记录型号，编号） 6.3.4 普通冰箱1台（记录型号，编号） 6.4 玻璃器皿及辅助用具/易耗品 6.4.1 已灭菌的10ml、1ml试管，2支/批。 6.4.2 已灭菌的操作衣及细胞瓶5个/批待检血清。 6.4.3 一次性使用无菌帽、无菌口罩和橡胶检查手套。记录批号。 6.4.4 75%酒精棉1瓶 6.4.5 酒精灯1个 6.4.6 烧杯1个 6.4.7 细胞计数器1个 6.4.8 六孔板1个作稀释用。 6.4.9 96孔细胞培养板，2个/批 流程图 无 操作程序 8.1. 准备 8.1.1 检定用具的清洗准备参见《物品准备程序》。 8.1.2 物料的进入 8.1.3 高压灭菌物品放入操作间，记录房间号。 8.1.4 酒精灯、75%酒精棉、细胞计数器、六孔稀释板、96孔细胞板及烧杯放入超净台 8.1.5 塑料桶、垃圾袋放入操作间。 8.1.6 每次操作前开启超净台，打开紫外灯和风机，消毒60分钟。 8.1.7 人员更衣，进入操作室。参见《人员进出洁净厂房程序》。 8.2 检测 8.2.1 细胞培养。 8.2.1.1 从普通冰箱中取出配制好的细胞生长液，放置30分钟，再放入超净台。 8.2.1.2 用10ml吸管往生长液中加供试血清，使血清终浓度为10%。每批供试血清配制150ml培养液。 8.2.1.3 从37℃CO2孵箱中拿出细胞瓶，放入超净台 8.2.1.4 75%酒精棉擦拭消毒瓶颈。 8.2.1.5 待细胞沉下后，打开瓶塞，倒掉培养液，再加入加有供试血清的细胞培养液10ml，传代。 8.2.1.6 记录细胞代次及生长情况 8.2.1.7 盖好瓶塞，把细胞瓶重放回37℃ CO2孵箱孵育2-3天。 8.2.1.8 填写细胞培养记录。填写清场记录。 8.2.1.9 如此反复操作，使细胞在加有10%供试血清的细胞培养液中适应传代三次，记录细胞生长情况。 8.2.2 细胞生长曲线的测定 8.2.2.1 从37℃CO2孵箱中拿出细胞培养液，放入超净台。 8.2.2.2 75%酒精棉擦拭消毒瓶颈。 8.2.2.3 打开瓶塞，倒掉培养液。 8.2.2.4 用10ml吸管加入新鲜培养液10ml。 8.2.2.5 然后在六孔板中用10ml和1ml吸管把细胞作10倍梯度稀释，用细胞计数器计数，使细胞浓度在1x104/ml。 8.2.2.6 用1ml吸管把细胞接种到96孔细胞培养板，每孔0.2ml，接种7孔。 8.2.2.7 置37℃ CO2孵箱中培养。 8.2.2.8 清场，填写记录。 8.2.2.9 从第二天开始，每天把细胞从37℃CO2孵箱中拿出，用1ml吸管加一滴到细胞计数器，计数活细胞，连续观察一周。每天记录活细胞数。 8.2.3 细胞倍增时间测定 8.2.3.1 按生长曲线计算细胞的倍增时间。具体见8.2.5.1 8.2.3.2 完成细胞倍增时间测定记录。 8.2.4 克隆率测定 8.2.4.1 用10ml吸管在六孔板中把经上述适应传代三次的细胞作10倍梯度稀释至1～ 2个细胞/ml。 8.2.4.2 用移液器接种到96孔细胞培养板中，每孔0.1ml，每批样品血清接种60孔。 8.2.4.3 置37℃CO2孵箱中培养一周。 8.2.4.4 接种结束，关闭超净台。 8.2.4.5 清场，填写清场记录。 8.2.4.6 一周后把96孔板从37℃CO2孵箱中取出。 8.2.4.7 倒置显微镜下观