第七章外源基因在真核细胞中的表达与调控详解演示文稿.pptVIP

BGH：Bovine Growth Hormone 当前第95页\共有156页\编于星期三\8点 pVAX1的特点 不仅具有在大肠杆菌中高拷贝复制和在多数哺乳类动物细胞中高效表达蛋白的特点, 而且pVAX1 具有卡那霉素抗性, 在人体内产生变应反应者较少。 pVAX1是由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒。迄今为止，关于pVAX1的研究已涉及动物和临床试验。 当前第96页\共有156页\编于星期三\8点 当前第97页\共有156页\编于星期三\8点 pEGFP-N1载体具有以下几方面特点： ①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。 当前第98页\共有156页\编于星期三\8点 GFP的相关知识： 　　绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因来源于Jellyfish Aequorea Victoria， 是Shimomura等于1962年发现的蛋白质，由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。GFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，但在还原环境下荧光会很快熄灭。 当前第99页\共有156页\编于星期三\8点 与以往常用的报告基因相比，GFP具有以下优点： 　　①在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；　　②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；　　③蛋白本身性质稳定；　　④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；　　⑤其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。 当前第100页\共有156页\编于星期三\8点 EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。 EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。 当前第101页\共有156页\编于星期三\8点 2.病毒型载体 外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重组DNA随病毒颗粒而复制(多需辅助病毒或包装细胞的存在)。 如：逆转录病毒载体、腺病毒载体等 当前第102页\共有156页\编于星期三\8点 病毒型载体的类型 整合型 整合入宿主染色体，随染色体复制而复制 可持续表达外源基因 安全性低：插入诱变 SV40载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体， 腺相关病毒载体 游离型 不整合 生物安全性高 瞬时表达 腺病毒载体，痘苗病毒载体 当前第103页\共有156页\编于星期三\8点 SV40(猴空泡病毒40)载体 dsDNA病毒，基因组约5.2kb 基因结构清楚,含有整套基因表达调控序列 早期区：T、t抗原（肿瘤蛋白质或抗原） T抗原是细胞转化的启动所必须的。 t抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。 晚期区：产生病毒衣壳蛋白（VP1，VP2及VP3)，包装病毒颗粒所必需 复制起始位点：早、晚区基因之间 当前第104页\共有156页\编于星期三\8点 当前第105页\共有156页\编于星期三\8点 特 点 载体构建：早期取代 晚期取代 天然SV40载体宿主范围窄，容量小（2.5kb） 易形成野生型病毒 溶源生长：导致宿主细胞裂解死亡 故较少使用，做瞬时转染用（转化COS细胞），或利用其调控元件。 pSV系列由SV40派生的一系列质粒型载体 当前第106页\共有156页\编于星期三\8点 当前第107页\共有156页\编于星期三\8点 当前第108页\共有156页\编于星期三\8点 逆转录病毒载体(RV) 基因组结构：ssRNA (9.2kb) LTR gag pol env LTR φ LTR（long terminal repeat）: 长末端重复序列, 含启动子和poly A信号, 介导病毒整合。 φ 包装信号：是包装病毒颗粒时所必须的非编码序列。 结构蛋白：核心蛋白 (ga