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标准化微孔板ames试验方法的研究 细菌回归实验（也称为ames试验）是由alice.n.a.20世纪70年代通过紫外辐射试验筛选出的带刺的不同组氨基酸营养缺陷的salmonelatyphic发生变化而建立的。 然而, 在进行毒理学初筛时, 往往难以合成或提取大量的受试物, 且大量初筛样本也带来了较大工作量。随着近30年来分子生物技术的突飞猛进, Ames试验技术也历经了一系列有助于改进检测效力和效率的改良。如通过引入含抗性因子质粒来提高试验体系的敏感度, 除沙门菌外也将有色氨酸营养缺陷型大肠杆菌 (E.coli) 纳为备选菌株, 使用微孔板 (如6孔板、24孔板、96孔板, 甚至384孔板) 或构建含荧光报告基因的质粒来实现高通量化 试验方法的标准化和背景数据积累对于Ames试验非常重要, 菌液在培养基中的比例, 以及阳性剂浓度之间的平衡等因素对背景值有明显影响。作为化合物致突变性初筛的首选, 当前微孔板Ames试验缺乏标准化以及背景数据的积累。此外, 保健食品、化妆品、医疗器械和药物安全性评价常规使用的菌株有所差异 1 材料表面 1.1 蘑菇 本研究使用菌株为鼠伤寒沙门菌组氨酸营养缺陷型 (his 1.2 营养汤试剂和其他试剂 阴性对照二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO) 、阳性对照2- (2-呋喃基) -3- (5-硝基-2-呋喃基) 丙烯酰胺 (2-2-Furyl-3-5-Nitro-2-Furylacrylamide, AF-2, Sigma) 、2-氨基蒽 (2-Aminoanthracene, 2-AA) 购自Sigma, 阳性对照叠氮钠 (sodium azide, NaN3) 购自Merck、9-氨基吖啶 (9-aminoacridine, 9-AA) 购自Acros Organics。其他试剂包括营养肉汤 (CM0067 nutrient broth No.2) 购自OXOID;琼脂粉 (agar powder) 、氨苄青霉素、葡萄糖、组氨酸、色氨酸、生物素、MgSO 1.3 细菌回复突变试验 试验流程简述如下, 底层琼脂、磷酸盐缓冲液、SEM顶层琼脂及S9混合液等配制方法此略 1.4 决定脱落总数和结果 计数每皿/孔中的回复菌落数量, 每个浓度组分别求得均值, 并以 2 阳性对照实验结果 本试验根据标准平皿法来对6孔板和24孔板Ames试验进行设计, 三者均为平板掺入法, 且所用试剂相同, 唯一的差异为后两者铺制的琼脂表面积少。本研究条件下顶层琼脂中每孔加样量分别为标准平皿法用量的1/3和1/10, 有文献报道miniAmes试验和micro-Ames试验的加样量可进一步减少约为标准平皿的1/5和1/20 然而阳性剂浓度2在微孔板Ames试验中的效力不如标准平皿。以TA102为例, AF-2在标准平皿、6孔板和24孔板中的添加量分别为0.01μg/皿、0.003μg/孔和0.001μg/孔时回复突变菌落数分别为 (1 185±64) 个/皿、 (45±7) 个/皿和 (5±2) 个/皿, 菌落突变数倍数比不呈10:3:1。此外, 上述突变菌落数值分别相同条件下对照组的4.2倍、1.7倍和0.6倍, 即在微孔板条件下浓度2不足以产生阳性结果 (表4～5) 。细菌生长速率与其周边的菌落密度相关 微孔法Ames试验的主要用途在于致突变性初筛, 减少所用菌株可进一步减少工作量和受试物用量。TA100是其中最敏感的菌株, 其次为TA98和TA1535。研究提示, 结合移码突变和点突变两种检测类型的菌株组合可有效检出大部分致突变剂, 如TA98/TA100、TA100/TA1535和TA98/TA1535可分别检出93%、87%和83%的致突变剂 3 缺少关于ames试验方法的探索 微孔板Ames试验可节省受试物和试剂的使用, 在早期致突变剂初筛时具有重要价值。但使用微孔板加样时易于有漏孔, 或可出现阴性背景值过少的情况, 而阳性剂的用量也不能照搬标准平皿中进行设置。故正式试验前, 需要进行一些前期摸索。当前国际上缺乏基于各种不同微孔板Ames试验方法的标准化方法。OECD自1997年首次颁布Ames试验指导原则